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花生過敏原Ara H2(Arah2)ELISA試劑盒
簡介
花生過敏原Ara H2是花生中最主要的致敏蛋白之一，占花生蛋白總量的約10%，其分子量為約17.20 kDa，等電點為5.2。Ara H2是花生過敏的主要致敏原，能夠引發(fā)嚴重的食物過敏反應，甚至導致過敏性休克。研究表明，90%以上的花生過敏患者血清中可以檢測到對Ara H2的特異性IgE抗體。Ara H2與其他花生過敏原（如Ara H1和Ara H3）相比，具有更高的致敏性和敏感性。例如，Ara H2檢測的陽性率顯著高于其他過敏原，且其特異性IgE檢測在診斷花生過敏中具有重要價值。此外，Ara H2能夠激活更多的樹突狀細胞，并在較低濃度下誘導更強的免疫反應。
本試劑盒Arah2免疫測定是一種三步法固相夾心ELISA，用于測量細胞培養(yǎng)上清液、血清和血漿中的Arah2。試劑盒包含大腸桿菌表達重組Arah2和針對重組蛋白產生的抗體。使用天然Arah2獲得的結果顯示出與使用重組標準品獲得的標準曲線平行的線性曲線。這些結果表明，該試劑盒可用于測定天然Arah2的相對質量值。
檢測原理
試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術：將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的待測物Arah2，孵育清洗后，再加入生物素標記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”免疫復合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結束后清洗，接著加入TMB顯色液后，若樣本中有待測物則顯藍色，則加入終止液停止反應。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中Arah2的濃度。
需要的其他材料
1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。
試劑準備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標準品配置
試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從640ng/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至32ng/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的32ng/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將32ng/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為：32ng/mL、16ng/mL、8ng/mL、4ng/mL、2ng/mL、1ng/mL、0.5ng/mL，從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0ng/mL)。
一抗工作液配置
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據(jù)所需用量配置。
酶標二抗工作液配置
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標二抗稀釋成1×酶標抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。
備 注：如樣本中待測物濃度高于標準品最高值，請根據(jù)實際情況選擇適當?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實驗之前做預實驗，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標準品母液及100×酶標二抗溶液根據(jù)實驗所需酶標板孔數(shù)吸取一定量配制工作液，剩余溶液應放回-20℃儲存，且避免反復凍融。（若實驗在1-2周內做完，標準品母液及100×酶標抗體置于2-8℃保存；若實驗為長時間跨度實驗，建議將標準品母液及100×酶標抗體置于-20℃保存，以保證實驗結果的穩(wěn)定性）
結果的計算
計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮?shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標準曲線。若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數(shù)。
精密度
批內精密度 ：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內精度評估。
批內變異系數(shù) CV%小于10%。
批間精密度 ：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內精度評估。
批間變異系數(shù) CV%小于15%。
回收率
樣本回收率：80% - 120%
靈敏度
經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.25ng/mL。
線性關系
分別在選取的4份健康血清、血漿和細胞培養(yǎng)上清中加入高濃度Arah2，在標準曲線動力學范圍內進行稀釋，評估線性。
本ELISA試劑盒實驗計算和曲線圖，請您下載產品說明書(供參考），本試劑盒僅供科研使用，不得用于臨床診斷和治療。
