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021-54845833/15800441009
堿性磷酸酶(AP)ELISA試劑盒
簡介
堿性磷酸酶（Alkaline Phosphatase，ALP）是一種普遍存在的膜結(jié)合糖蛋白，主要功能是催化有機磷酸酯的水解或去除生物礦化的抑制劑無機焦磷酸(PPI)。ALP是乳品加工工業(yè)中非常重要的一個指標(biāo)，它標(biāo)志著乳制品巴氏殺菌的成功與否。ALP的熱穩(wěn)定性略高于乳中的大部分致病微生物，如結(jié)核桿菌、李斯特菌等。在56℃，30分鐘的條件下，ALP就會發(fā)生熱變性。而在巴氏殺菌（72℃，15秒）的條件下，ALP的活性會大幅降低至350 mU/L以下。當(dāng)牛奶熱處理強度足以使ALP活性檢測結(jié)果為陰性時，說明其他病原微生物也被完全滅活。ALP的活性測定通常是快速驗證牛奶巴氏殺菌過程的標(biāo)準方法，如果ALP活性降低，表明牛奶從微生物學(xué)角度來看是安全的。但ALP在人體中的水平異常升高時，會帶來肝臟，骨骼等疾病相關(guān)的潛在問題。本酶聯(lián)免疫檢測試劑盒可以經(jīng)濟、快速地檢測樣品中的ALP的含量。
檢測原理
本試劑盒采用間接競爭ELISA方法，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中ALP和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭ALP抗體，加入酶標(biāo)二抗后，形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。隨后結(jié)合的酶催化TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的ALP成負相關(guān)。通過標(biāo)準曲線可準確定量樣品中ALP的含量。通過標(biāo)準曲線計算所得值乘以樣品處理的稀釋倍數(shù)即為實際樣品中ALP的含量。
需要的其他材料
1. 酶標(biāo)儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標(biāo)準品和樣品的試管。
試劑準備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標(biāo)準品配置
試劑盒中取出標(biāo)準品，準備7個試管，先將2000ppb標(biāo)準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至51ppb（例：26μL的標(biāo)準品母液+974μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的51ppb濃度標(biāo)準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將51ppb標(biāo)準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標(biāo)準品，依次為：51ppb、25.5 ppb、12.8ppb、6.4ppb、3.2ppb、1.6ppb、0.8ppb，從最高濃度標(biāo)準品溶液中吸取500μL標(biāo)準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標(biāo)準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準品(0ppb)。
一抗工作液配置
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據(jù)所需用量配置。
酶標(biāo)二抗工作液配置
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標(biāo)二抗稀釋成1×酶標(biāo)抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。
備 注：如樣本中待測物濃度高于標(biāo)準品最高值，請根據(jù)實際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實驗之前做預(yù)實驗，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標(biāo)準品母液及100×酶標(biāo)二抗溶液根據(jù)實驗所需酶標(biāo)板孔數(shù)吸取一定量配制工作液，剩余溶液應(yīng)放回-20℃儲存，且避免反復(fù)凍融。（若實驗在1-2周內(nèi)做完，標(biāo)準品母液及100×酶標(biāo)抗體置于2-8℃保存；若實驗為長時間跨度實驗，建議將標(biāo)準品母液及100×酶標(biāo)抗體置于-20℃保存，以保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性）
結(jié)果的計算
計算標(biāo)準品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準曲線(作圖時去掉空白組的值)。或者使用能夠生成四參數(shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標(biāo)準曲線。若樣品OD值高于標(biāo)準曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
精密度
批內(nèi)精密度 ：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在同一個板塊內(nèi)精度評估。
批內(nèi)變異系數(shù) CV%小于10%。
批間精密度 ：三組已知的高、中、低濃度樣品，進行二十次在不同板塊內(nèi)精度評估。
批間變異系數(shù) CV%小于15%。
回收率
樣本回收率：80% - 120%
靈敏度
經(jīng)樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為0.8 ppb。
線性關(guān)系
校準品劑量反應(yīng)曲線相關(guān)系數(shù)r值，大于等于0.998。
本ELISA試劑盒實驗計算和曲線圖，請您下載產(chǎn)品說明書(供參考），本試劑盒僅供科研使用，不得用于臨床診斷和治療。
