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雞轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)試劑盒
簡(jiǎn)介
轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1），由TGFB1基因編碼，它是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β細(xì)胞因子超家族的多肽成員。它是一種分泌蛋白，具有多種細(xì)胞功能，包括控制細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化和凋亡，它在控制免疫系統(tǒng)方面起著重要作用，在不同類型的細(xì)胞或處于不同發(fā)育階段的細(xì)胞上顯示出不同的活性，大多數(shù)免疫細(xì)胞（或白細(xì)胞）分泌TGF-β1。它可防止活化T細(xì)胞中的白細(xì)胞介素（IL）-1-和白細(xì)胞介素-2 依賴性增殖以及靜止輔助T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞的激活，它可以抑制許多其他細(xì)胞因子的分泌和活性，包括干擾素γ，腫瘤壞死因子α和各種白細(xì)胞介素，它還可以降低細(xì)胞因子受體的表達(dá)水平，例如 IL-2 受體，以降低免疫細(xì)胞的活性，它也可以增加T細(xì)胞中某些細(xì)胞因子的表達(dá)并促進(jìn)其增殖。它對(duì)B細(xì)胞具有相似的作用，這些作用也根據(jù)細(xì)胞的分化狀態(tài)而變化。它抑制增殖，刺激B細(xì)胞的凋亡，并控制抗體，轉(zhuǎn)鐵蛋白和MHC II類蛋白在未成熟和成熟B細(xì)胞上的表達(dá)，它對(duì)巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞的影響主要是抑制性的；這種細(xì)胞因子可以抑制這些細(xì)胞的增殖，并阻止它們產(chǎn)生活性氧和氮中間體，與其他細(xì)胞類型一樣，它也可以對(duì)骨髓來(lái)源的細(xì)胞產(chǎn)生相反的影響。
檢測(cè)原理
本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù) : 將捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，捕獲樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的待測(cè)物TGF-β1，清洗后，再加入生物素標(biāo)記的檢測(cè)抗體進(jìn)行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測(cè)抗體”免疫復(fù)合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過(guò)氧化物酶進(jìn)行孵育，待孵育結(jié)束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測(cè)物則顯藍(lán)色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測(cè)過(guò)程中游離的成分均被洗去，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)OD值，顏色的深淺和樣品中的待測(cè)物的含量呈正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣本中TGF-β1的濃度。
需要的其他材料
1. 酶標(biāo)儀，包含450nm測(cè)定波長(zhǎng)，同時(shí)包含600-680nm校正波長(zhǎng)更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動(dòng)微孔板清洗機(jī)；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。
樣品保存
樣品收集后若在 1 周內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)的可保存于4℃，若不能及時(shí)檢測(cè)，請(qǐng)按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），或-80℃（6個(gè)月內(nèi)檢測(cè)），避免反復(fù)凍融，標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。
試劑準(zhǔn)備工作
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標(biāo)準(zhǔn)品配置
試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個(gè)試管，先從20ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至1000pg/mL（例：50μL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的1000pg/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個(gè)試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個(gè)單獨(dú)的試管中將1000pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍倍比稀釋至6個(gè)梯度，共配制7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為: 1000pg/mL、 500pg/mL、 250pg/mL、 125pg/mL、 62.5pg/mL、 31.25pg/mL、 15.63pg/mL，從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個(gè)試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0pg/mL)。
抗體工作液配置
使用前10分鐘，將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據(jù)所需用量當(dāng)日配置當(dāng)日使用。
酶結(jié)合物工作液配置
使用前10分鐘，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據(jù)所需用量配置。
備 注：如待測(cè)樣TGF-β1度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。
結(jié)果的計(jì)算
計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(作圖時(shí)去掉空白組的值)?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮?shù)邏輯（4-P）曲線擬合的計(jì)算機(jī)軟件來(lái)創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
示例數(shù)據(jù)
標(biāo)準(zhǔn)品濃度(pg/mL)
1000
500
250
125
62.5
31.25
15.63
0
OD值
2.510
1.7
0.997
0.641
0.393
0.228
0.172
0.063
校正OD值
2.447
1.637
0.934
0.578
0.33
0.165
0.109
0
以下數(shù)據(jù)和曲線僅供參考，實(shí)驗(yàn)者需根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。
下圖所示標(biāo)準(zhǔn)曲線僅供示例，結(jié)果計(jì)算應(yīng)以同次試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)品所繪標(biāo)準(zhǔn)曲線為準(zhǔn)計(jì)算樣本結(jié)果
重復(fù)性
板內(nèi)變異系數(shù)小于10%，板間變異系數(shù)小于10%。
靈敏度
經(jīng)樣本測(cè)試，本試劑盒的檢測(cè)靈敏度為7.82pg/mL。
特異性
該試劑盒測(cè)定可識(shí)別重組雞TGF-β1。
其他相關(guān)蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測(cè)定交叉反應(yīng)性。沒(méi)有觀察到明顯的交叉反應(yīng)。
使用ELISA試劑盒之前，請(qǐng)您必須完整閱讀說(shuō)明書，本產(chǎn)品僅供科研使用，不得用于臨床診斷和治療。
