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大鼠 TNF-α 檢測試劑盒說明書
僅供體外研究使用，不用于臨床診斷！
產(chǎn)品介紹
大鼠 TNF-α 試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)，用于體外定量檢測血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中大鼠 TNF-α 的含量。
- 有效期：6個(gè)月
- 保存條件：2-8℃
實(shí)驗(yàn)原理
大鼠 TNF-α 試劑盒試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) (ELISA)。往預(yù)先包被大鼠 TNF-α 捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并徹底洗滌。用底物 TMB 顯色，TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠 TNF-α 呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長下測定吸光度 (OD 值)，計(jì)算樣品濃度。
樣本處理及要求
- 血清：將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置 2 小時(shí)或 4℃ 過夜，然后 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可，或?qū)⑸锨逯糜?-20℃ 或 -80℃ 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
- 血漿：用 EDTA 或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本，并將標(biāo)本在采集后的 30 分鐘內(nèi)于 2-8℃ 1000×g 離心 15 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?-20℃ 或 -80℃ 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
- 組織勻漿：用預(yù)冷的 PBS (0.01M, pH=7.4) 沖洗組織，去除殘留血液（勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測量結(jié)果），稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對應(yīng)體積的 PBS（一般按 1:9 的重量體積比，比如 1g 的組織樣品對應(yīng) 9mL 的 PBS，具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整，并做好記錄。推薦在 PBS 中加入蛋白酶抑制劑）加入玻璃勻漿器中，于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞，可以對勻漿液進(jìn)行超聲破碎，或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于 5000×g 離心 5~10 分鐘，取上清檢測。
- 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：請 1000×g 離心 20 分鐘，取上清即可檢測，或?qū)⑸锨逯糜?-20℃ 或 -80℃ 保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注： 標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。
所需而未提供的試劑和器材
- 酶標(biāo)儀 (450nm)
- 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
- 37℃ 恒溫箱
- 蒸餾水或去離子水
大鼠 TNF-α 試劑盒組成
| 名稱 |
96 孔配置 |
48 孔配置 |
備注 |
|
微孔酶標(biāo)板 |
8 孔×12 條 |
8 孔×6 條 |
無 |
|
標(biāo)準(zhǔn)品 |
0.3mL*6 管 |
0.3mL*6 管 |
無 |
|
樣本稀釋液 |
6mL |
3mL |
無 |
|
檢測抗體-HRP |
10mL |
5mL |
無 |
|
20×洗滌緩沖液 |
25mL |
15mL |
按說明書進(jìn)行稀釋 |
|
底物 A |
6mL |
3mL |
無 |
|
底物 B |
6mL |
3mL |
無 |
|
終止液 |
6mL |
3mL |
無 |
|
封板膜 |
2 張 |
2 張 |
無 |
|
說明書 |
1 份 |
1 份 |
無 |
|
自封袋 |
1 個(gè) |
1 個(gè) |
無 |
|
空白稀釋板 |
1 塊 |
1 塊 |
選配 |
|
橡膠手套 |
2 副 |
2 副 |
選配 |
備注：
- 標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為：200、100、50、25、12.5、6.25 pg/mL
- 經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗(yàn)，標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi)，實(shí)驗(yàn)過程中直接取 50μL 樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí)，可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)
- 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫 20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。
- 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。
- 消除板底殘留的液體和手指印，否則影響 OD 值。
- 底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。
- 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。
- 在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。
- 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。
- 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。
- 不能使用過期產(chǎn)品。
- 如果可能傳播疾病，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。
試劑準(zhǔn)備
- 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。
- 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按 1：20 稀釋，即 1 份 20×洗滌緩沖液加 19 份蒸餾水。
大鼠 TNF-α 試劑盒操作步驟
- 從室溫平衡 20min 后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回 4℃。
- 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 50μL；
- 樣本孔中加入待測樣本 50μL；空白孔不加。
- 除空白孔外，標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶 (HRP) 標(biāo)記的檢測抗體 100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃ 水浴鍋或恒溫箱溫育 60min。
- 棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液 (350μL)，靜置 1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板 5 次 (也可用洗板機(jī)洗板)。
- 每孔加入底物 A、B 各 50μL，37℃ 避光孵育 15min。
- 每孔加入終止液 50μL，15min 內(nèi)，在 450nm 波長處測定各孔的 OD 值。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算
以所測標(biāo)準(zhǔn)品的 OD 值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的 OD 值代入方程，計(jì)算出樣品的濃度。
大鼠 TNF-α 試劑盒性能
- 檢測范圍：6.25 pg/mL – 200 pg/mL。
- 靈敏度：最低檢測濃度小于 1.0 pg/mL。
- 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。
- 重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于 10% ，板間變異系數(shù)小于 15% 。
大鼠 TNF-α 試劑盒說明
- 由于現(xiàn)有條件及科學(xué)技術(shù)水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進(jìn)行全面的鑒定與分析，本產(chǎn)品可能存在一定的質(zhì)量技術(shù)風(fēng)險(xiǎn)。
- 最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與試劑的有效性、實(shí)驗(yàn)者的相關(guān)操作以及當(dāng)時(shí)的實(shí)驗(yàn)環(huán)境密切相關(guān)，請務(wù)必準(zhǔn)備充足的標(biāo)本備份。
- 不同批次的同一產(chǎn)品可能會(huì)有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時(shí)間等，請依據(jù)試劑盒內(nèi)說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，網(wǎng)站電子版說明書僅作參考。
- 只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他制造商的產(chǎn)品。只有嚴(yán)格遵守本試劑盒的實(shí)驗(yàn)說明才會(huì)得到最佳的檢測結(jié)果。
- 本公司只對試劑盒本身負(fù)責(zé)，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負(fù)責(zé)，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預(yù)留充足的樣本。
- 使用化學(xué)裂解液制備的組織勻漿或細(xì)胞提取液可能會(huì)由于某些化學(xué)物質(zhì)的引入導(dǎo)致 ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏差。
- 若樣本為細(xì)胞培養(yǎng)上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細(xì)胞狀態(tài)、細(xì)胞數(shù)量、采樣時(shí)間等，所以可能存在檢測不出的情況。
- 某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因?yàn)榕c本產(chǎn)品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。
