小腸結(jié)腸炎耶爾森菌探針法熒光定量PCR試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn)：

小腸結(jié)腸炎耶爾森菌(Yersinia enterocolitica)為革蘭氏陰性桿菌或球桿菌，分布很廣，可存在于生的蔬菜、乳和乳制品、肉類、豆制品、沙拉、牡蠣、蛤和蝦。也存在于環(huán)境中，如湖泊、河流、土壤和植被。在港灣周圍，許多鳥類包括水禽和海鷗可能是帶菌者。小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是30年代引起注意的急性胃腸炎型食物中毒的病原菌，為人畜共患病，主要癥狀表現(xiàn)為發(fā)熱、腹痛、腹瀉、嘔吐、關(guān)節(jié)炎、敗血癥等。耶爾森氏菌病典型癥狀常為胃腸炎癥狀、發(fā)熱、亦可引起闌尾炎。有的引起反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎，另一個(gè)并發(fā)癥是敗血癥，即血液系統(tǒng)感染，盡管較少見，但死亡率較高。本菌對(duì)易染人群為嬰幼兒，常引起發(fā)熱、腹痛和帶血的腹瀉，因此快速檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌具有重要意義。熒光定量PCR是檢測(cè)傳染性疾病的主流技術(shù)，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌的試劑盒。

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他病毒 DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。

規(guī)格及成分：

編號(hào)	成分	規(guī)格
試劑一	2×Probe qPCR MagicMix	500μL(本色蓋)
試劑三	熒光PCR專用模板稀釋液	1 mL(黃蓋)
試劑二	小腸結(jié)腸炎耶爾森菌qPCR引物混合液	100μL(白蓋)
試劑四	小腸結(jié)腸炎耶爾森菌qPCR探針	50μL(棕色管)
試劑五	小腸結(jié)腸炎耶爾森菌探針法qPCR陽性對(duì)照(1×10E8/μL)	50μL(紅蓋)
使用手冊(cè)		1 份

運(yùn)輸及保存：

低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。

自備試劑：

樣品 RNA。

使用方法：

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）：

由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對(duì)照。

1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。

6. 放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備：

7. 如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL 陽性對(duì)照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）：

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：

成份	N+2個(gè)樣品管	PCR陰性對(duì)照管	標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管(2-7管)
2×ProbeqPCRMagicMix	10μL	10μL	各10μL
小腸結(jié)腸炎耶爾森菌qPCR探針	1μL	1μL	各1μL
小腸結(jié)腸炎耶爾森菌探針法qPCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
N+2個(gè)待測(cè)DNA模板	7μL	--	--
超純水	--	7μL	--
第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液(2-7號(hào))	--	--	各7μL(2號(hào)樣到2號(hào)管，3號(hào)樣到3號(hào)管)

11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：

過程	溫度	時(shí)間
預(yù)變性	95℃	3 min
PCR 反應(yīng)40個(gè)循環(huán)	95℃	15 sec
PCR 反應(yīng)40個(gè)循環(huán)	60℃	1 min(采集FAM通道的熒光信號(hào))

四、數(shù)據(jù)處理：

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct值小于 40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。

五、特別提示：

本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

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