產(chǎn)品及特點(diǎn)：
陰溝腸桿菌(Enterobacter cloacae)是腸桿菌目腸桿菌科腸桿菌屬的一種細(xì)菌，廣泛存在于自然界中，在人和動(dòng)物的糞便水、泥土、植物中均可檢出，是腸道正常菌種之一。其引起的細(xì)菌感染性疾病，常累及多個(gè)器官系統(tǒng)，包括皮膚軟組織感染、泌尿道感染呼吸道感染以及敗血癥等由于陰溝腸桿菌能產(chǎn)生超廣譜β內(nèi)酰胺酶(extended-spectrum β-lactamases，ESBLs)和 Amp C 酶耐藥情況嚴(yán)重，給臨床治療帶來了新的挑戰(zhàn)。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測陰溝腸桿菌的試劑盒。
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)陰溝腸桿菌高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他病毒 DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。
規(guī)格及成分：
|
編號
|
成分
|
規(guī)格
|
|
試劑一
|
2×Probe qPCR MagicMix
|
500μL（本色蓋）
|
|
試劑三
|
熒光PCR專用模板稀釋液
|
1mL（黃蓋）
|
|
試劑二
|
陰溝腸桿菌桿菌屬通用PCR引物混合液
|
100μL（白蓋）
|
|
試劑四
|
陰溝腸桿菌qPCR探針
|
50μL（棕色管）
|
|
試劑五
|
陰溝腸桿菌qPCR陽性對照照(1×10E8/μL)
|
50μL（紅蓋）
|
|
使用手冊
|
1份
|
運(yùn)輸及保存：
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。
自備試劑：
樣品 RNA。
使用方法：
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）：
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。
6. 放冰上待用。重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備：
7. 如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性對照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）：
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：
|
成份
|
N+2個(gè)樣品管
|
PCR陰性對照管
|
標(biāo)準(zhǔn)曲線
樣品管（2-7管）
|
|
2×Probe qPCR MagicMix
|
10μL
|
10μL
|
各10μL
|
|
陰溝腸桿菌qPCR探針
|
1μL
|
1μL
|
各1μL
|
|
陰溝腸桿菌qPCR引物混合液
|
2μL
|
2μL
|
各2μL
|
|
N+2個(gè)待測DNA模板
|
7μL
|
--
|
--
|
|
超純水
|
--
|
7μL
|
--
|
|
第7步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液（2-7號）
|
--
|
--
|
各7μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管）
|
11. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行PCR：
|
過程
|
溫度
|
時(shí)間
|
|
預(yù)變性
|
95℃
|
3 min
|
|
PCR 反應(yīng)40個(gè)循環(huán)
|
95℃
|
15 sec
|
|
60℃
|
1 min(采集FAM通道的熒光信號)
|
四、數(shù)據(jù)處理：
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct值小于 40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。
五、特別提示：
本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！
購物車
幫助
021-54845833/15800441009
