產(chǎn)品及特點：
節(jié)瘤擬桿菌(Dichelobacter nodosus)是引起牛、羊、鹿等反芻動物腐蹄病的原發(fā)性病原菌,腐蹄病是危害反芻動物養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要疾病之一,節(jié)瘤擬桿菌引起動物局部淺表損害,病程緩慢,機體抗體反應延遲,抗體產(chǎn)生量少。節(jié)瘤擬桿菌是通過Ⅳ型纖毛和細胞外蛋白酶而產(chǎn)生作用。但從腐蹄病發(fā)病癥狀看,節(jié)瘤擬桿菌所致疾病的嚴重程度不是相同的,據(jù)此節(jié)瘤擬桿菌被分為毒性,弱毒性和良性菌這種分類通過對該菌基因組毒性關(guān)聯(lián)蛋白Vap(Virulence—associated protein)區(qū)域和毒性相關(guān)位點vrl(Virulence Related Locus)區(qū)域,發(fā)現(xiàn)其致病特點與基因的順序有很大聯(lián)系。因此快速檢測節(jié)瘤擬桿菌具有重要意義。
因此快速檢測節(jié)瘤擬桿菌具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎開發(fā)的專門檢測節(jié)瘤擬桿菌的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)節(jié)瘤擬桿菌高度保守區(qū)設計，不會跟其他病毒 DNA發(fā)生交叉反應。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。
規(guī)格及成分：
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編號
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成分
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規(guī)格
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試劑一
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2×Probe qPCR MagicMix
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500μL（本色蓋）
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試劑三
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熒光PCR專用模板稀釋液
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1mL（黃蓋）
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試劑二
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節(jié)瘤擬桿菌探針法qPCR引物混合液
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100μL（白蓋）
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試劑四
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節(jié)瘤擬桿菌探針法qPCR探針
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50μL（棕色管）
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試劑五
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節(jié)瘤擬桿菌探針法qPCR陽性對照(1×10E8/μL)
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50μL（紅蓋）
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使用手冊
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1份
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運輸及保存：
低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
自備試劑：
樣品DNA。
使用方法：
一、稀釋標準曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)：
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。
6. 放冰上待用。重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備：
7. 如果有 N 個樣品，最好設置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR反應(20μL體系，在樣品制備室進行)：
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
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成份
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N+2個樣品管
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PCR陰性對照管
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標準曲線樣品管2-7管
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2×Probe qPCR MagicMix
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10μL
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10μL
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各10μL
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節(jié)瘤擬桿菌探針法qPCR探針
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1μL
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1μL
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各1μL
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節(jié)瘤擬桿菌qPCR引物混合液
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2μL
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2μL
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各2μL
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N+2個待測DNA模板
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7μL
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超純水
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7μL
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第7步所得標準曲線樣品稀釋液2-7號
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--
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各7μL2號樣到2號管,3號樣到3號管
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11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR：
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過程
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溫度
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時間
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預變性
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95℃
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3 min
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PCR反應40個循環(huán)
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95℃
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15 sec
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60℃
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1 min(采集FAM通道的熒光信號)
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四、數(shù)據(jù)處理：
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復結(jié)果 Ct值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。
五、特別提示：
本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！
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