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021-54845833/15800441009
簡介
FLAG標簽，或FLAG八肽，或FLAG表位，是一種多肽蛋白質標簽，可以用重組DNA技術添加到蛋白質中，其序列圖案為DYKDDDDK(其中D=天冬氨酸，Y=酪氨酸，K=賴氨酸)，它是最特異的標簽之一，是一種通用種 屬工抗原，已經開發(fā)出特異的、高親和力的單克隆抗體，因此可用于親和層析法的蛋白質純化，也可用于定位活細胞內的蛋白質。它已被用于分離重組的、過量表達的蛋白和宿主生物體表達的野生型蛋白，它還可用于分離具有多個亞單位的蛋白質復合物，因為其溫和的純化過程往往不會破壞這種復合物。它已被用于獲得足夠純度和質量的蛋白質，以通過X射線晶體學進行三維結構測定，F(xiàn)LAG標簽可用于許多需要抗體識別的不同檢測中，如果沒有針對某一特定蛋白的抗體，在蛋白上添加FLAG標記，就可以用針對FLAG序列的抗體來研究該蛋白，例如通過免疫熒光、免疫沉淀或通過SDS PAGE蛋白電泳和Western印跡檢測進行細胞定位研究，從N端到C端的FLA標簽的肽序列是，DYKDDDDK(1012Da)，此外，它還可以串聯(lián)使用，常見的是3xFLAG肽，DYKDHD-G-DYKDHD-I-DYKDDDDK(最后一個標簽編碼一個腸激酶裂解位點)。它可以與蛋白質的C端或N端融合，或插入到蛋白質內。一些市售的抗體(如 M1/4E11)只有在N端出現(xiàn)時才能識別該表位，然而，其他可用的抗體(如M2)則對位置不敏感，F(xiàn)LAG標簽中的酪氨酸殘基可以被硫酸化，這可能會影響抗體對FLAG表位的識別，F(xiàn)LAG標簽可以與其他親和力標簽一起使用，例如多組氨酸標簽(His標簽)、HA標簽或myc標簽。
檢測原理
本試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術 : 將捕獲抗體包被于酶標板上，捕獲樣品及標準品中的待測物Flag-tag，清洗后，再加入生物素標記的檢測抗體進行孵育后清洗，形成“捕獲抗體-抗原-檢測抗體”免疫復合物，隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)的辣根過氧化物酶進行孵育，待孵育結束后清洗，接著加入TMB顯色后，若樣本中有待測物則顯藍色，加入終止液停止反應。檢測過程中游離的成分均被洗去，用酶標儀在450 nm處測OD值，顏色的深淺和樣品中的待測物的含量呈正比，通過繪制標準曲線計算出樣本中Flag-tag的濃度。
需要的其他材料
1. 酶標儀，包含450nm測定波長，同時包含600-680nm校正波長更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000 mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動微孔板清洗機；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標準品和樣品的試管。
樣品保存
樣品收集后若在 1 周內進行檢測的可保存于4℃，若不能及時檢測，請按一次使用量分裝，凍存于-20℃（1個月內檢測），或-80℃（6個月內檢測），避免反復凍融，標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。
試劑準備工作
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋（例如：1mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標準品配置
試劑盒中取出標準品，準備7個試管，先從40ng/mL標準品（200μL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至2000pg/mL（例：50μL的標準品母液+950μL的1×稀釋液，制備得到1000μL的2000pg/mL濃度標準品），隨后在6個試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個單獨的試管中將2000pg/mL標準品依次2倍倍比稀釋至6個梯度，共配制7個濃度的標準品，依次為: 2000pg/mL、 1000pg/mL、 500pg/mL、 250pg/mL、 125pg/mL、 62.5pg/mL、 31.25pg/mL，從最高濃度標準品溶液中吸取500μL標準品到下一個試管中，輕輕吹打混勻，以此類推進行標準品的倍比稀釋（如圖所示），1×稀釋液用作零濃度標準品(0pg/mL)。
抗體工作液配置
使用前10分鐘，將100×生物素化抗體于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×生物素化抗體稀釋成1×生物素化抗體工作液，根據所需用量當日配置當日使用。
酶結合物工作液配置
使用前10分鐘，將100×SA-HRP溶液于1000×g離心1分鐘，隨后用1×稀釋液將100×SA-HRP稀釋成1×SA-HRP工作液，根據所需用量配置。
備 注：如待測樣本中Flag-tag濃度高于標準品最高值，請根據實際情況選擇適當的稀釋倍數。
結果的計算
計算標準品和樣本復孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，在坐標紙上繪出四參數邏輯函數的標準曲線(作圖時去掉空白組的值)?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮颠壿嫞?-P）曲線擬合的計算機軟件來創(chuàng)建標準曲線。若樣品OD值高于標準曲線上限，應適當稀釋后重測并在計算樣本濃度時乘以相應的稀釋倍數。
示例數據
標準品濃度(pg/mL)
2000
1000
500
250
125
62.5
31.25
0
OD值
2.474
1.607
1.025
0.699
0.431
0.271
0.161
0.058
2.416
1.549
0.967
0.641
0.373
0.213
0.103
0
以下數據和曲線僅供參考，實驗者需根據自己的實驗數據建立標準曲線。
下圖所示標準曲線僅供示例，結果計算應以同次試驗標準品所繪標準曲線為準計算樣本結果
重復性
板內變異系數小于10%，板間變異系數小于10%。
靈敏度
經樣本測試，本試劑盒的檢測靈敏度為15.63pg/mL。
特異性
該試劑盒測定可識別重組人Flag-tag。
其他相關蛋白在稀釋緩沖液中制備為50ng/mL，并測定交叉反應性。沒有觀察到明顯的交叉反應。
使用ELISA試劑盒之前，請您必須完整閱讀說明書，本產品僅供科研使用，不得用于臨床診斷和治療。
