產(chǎn)品及特點(diǎn)
豬托克特諾病毒(Torque Teno Sus Virus, TTSuV)是一種新型環(huán)狀單鏈DNA病毒，又稱之為豬細(xì)環(huán)病毒。該病毒廣泛存在于不同代次的豬源原代、繼代細(xì)胞以及正常豬的體內(nèi)。主要引起發(fā)熱、精神不振、被毛粗亂、漸進(jìn)性消瘦，貧血，肌肉萎縮，衰弱無(wú)力，呼吸困難，咳嗽，水樣下痢或黑便等癥狀。豬托克特諾病毒1型(Torque Teno Sus Virus 1, TTSuV-1)在我國(guó)不少地區(qū)豬群中廣泛流行，單獨(dú)感染可引起仔豬出現(xiàn)一定的病理變化，因此快速檢測(cè)豬托克特諾病毒1型具有重要意義。
細(xì)環(huán)病毒(Torque Teno Virus, TTV)病毒體近似球形，直徑約30nm，無(wú)包膜，其基因組為環(huán)狀單鏈反義DNA，長(zhǎng)約3.8kb。細(xì)環(huán)病毒19型(Torque Teno Virus 19, TTV-19)是指環(huán)病毒科甲型細(xì)環(huán)病毒屬(Alphatorquevirus spp.)的亞種之一。本產(chǎn)品就是以探針法qPCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門對(duì)豬托克特諾病毒1型/細(xì)環(huán)病毒19型進(jìn)行檢測(cè)和分型的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。
3. 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于排除假陰性結(jié)果。
4. 特異性高，引物是根據(jù)TTSuV-1/TTV-19 DNA高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。
6. 兩個(gè)探針分別用FAM和HEX標(biāo)記，檢測(cè)和分型同時(shí)完成。
7. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng)。
8. 本產(chǎn)品只能用于科研。
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成分
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規(guī)格
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包裝
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2×Probe qPCR MasterMix
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0.5mL
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0.5mL本色蓋
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熒光PCR專用模板稀釋液
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1mL
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1.5mL綠蓋管
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超純水
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50次
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1.5mL棕色管
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TTSuV-1/TTV-19雙重qPCR引物-探針干粉
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50μL
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0.5mL黃蓋管
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TTSuV-1 qPCR陽(yáng)性對(duì)照(1×10E7拷貝/μL)
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50μL
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0.5mL白蓋管
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使用手冊(cè)
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1份
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無(wú)
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入216 uL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。
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使用方法
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以陽(yáng)性對(duì)照10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為A6，A5，A4，A3，A2，A1。
2. 在A1-A6號(hào)管中各加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液。
3. 在A6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線PC樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在A5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在A4號(hào)管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作得到A1-A6共六個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線陽(yáng)性樣品。放冰上待用。
稀釋TTV-19檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品
7. 操作同上，只是使用TTV-19的PC作為模板。得到6個(gè)濃度的樣本放冰上待用，分別是B1-B6。
樣品DNA的制備
8. 如果有N個(gè)樣品，設(shè)置N+3個(gè)提取，多出的一個(gè)是TTSuV-1的PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是TTV-19的PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL第一步和第二步所得的4號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟樣本制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此分別作為兩個(gè)PC。另外用水作為NC，水的總體積需要跟樣本制備試劑盒所要求的樣本體積一樣。
9. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)樣品DNA提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應(yīng)20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行
10. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+3+1+6+6個(gè)PCR管，其中N+3個(gè)用于上步得到的N+3個(gè)樣品，1個(gè)用于qPCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于TTSuV-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線，另外6個(gè)用于TTV-19的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+3+3個(gè)qPCR管，其中N+3個(gè)用于上步得到的N+3個(gè)樣品，1個(gè)用于RT-PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于TTSuV-1 qPCR陽(yáng)性對(duì)照，1個(gè)用于TTV-19 qPCR陽(yáng)性對(duì)照（直接用第一步和第二步所得的兩個(gè)4號(hào)稀釋液作為模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照或制備陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果為陰性，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴(kuò)增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴(kuò)增陰性對(duì)照或制備陰性對(duì)照結(jié)果為陽(yáng)性，說明環(huán)境污染，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系，購(gòu)買新的引物和探針。
2. 如果陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照正常，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，分別以陽(yáng)性對(duì)照（FAM通道）和（HEX通道）的Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，陽(yáng)性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)曲線為斜線，r2必須大于0.95。再以待測(cè)樣品的Ct值從陽(yáng)性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 對(duì)定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照的Ct必須大于40，或者沒有Ct值。陽(yáng)性對(duì)照的熒光信號(hào)必須有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于40。對(duì)待測(cè)樣品，如果其FAM通道的Ct大于40則為TTSuV-1陰性，如果小于或等于40則為TTSuV-1陽(yáng)性。如果其HEX通道的Ct大于40則為TTV-19陰性，如果小于或等于40則為TTV-19陽(yáng)性。
自備試劑
超純水，樣品DNA
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
購(gòu)物車
幫助
021-54845833/15800441009
