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人冠狀病毒229E 探針法qRT-PCR試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)
人冠狀病毒229E（Human Coronavirus 229E，HCoV-229E）為有膜單股正鏈RNA病毒，全長(zhǎng)為27271 nt。該病毒是造成兒童流行性感冒的主要病原，感染呼吸道主要引起輕度呼吸道感染癥狀，重癥有發(fā)熱嘔吐腹瀉癥狀，糞便中帶有黏液。人冠狀病毒229E感染嚴(yán)重影響兒童身體健康，因此人冠狀病毒229E的快速檢測(cè)具有重要意義，為此本公司以探針法qPCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)了人冠狀病毒229E的檢測(cè)試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
產(chǎn)品及特點(diǎn)
人冠狀病毒229E（Human Coronavirus 229E，HCoV-229E）為有膜單股正鏈RNA病毒，全長(zhǎng)為27271 nt。該病毒是造成兒童流行性感冒的主要病原，感染呼吸道主要引起輕度呼吸道感染癥狀，重癥有發(fā)熱嘔吐腹瀉癥狀，糞便中帶有黏液。人冠狀病毒229E感染嚴(yán)重影響兒童身體健康，因此人冠狀病毒229E的快速檢測(cè)具有重要意義，為此本公司以探針法qPCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)了人冠狀病毒229E的檢測(cè)試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。
3. 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)人冠狀病毒229E的RNA高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。
6. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法qRT-PCR反應(yīng)。
7. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
使用方法
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以1E1-1E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照。如果需要RNA陽(yáng)性樣品，需要另外訂購(gòu)。
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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探針法qRT-PCR緩沖液 |
500μL |
0.5mL藍(lán)蓋管 |
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探針法qRT-PCR酶混合液v2 |
50μL |
0.5mL紅蓋管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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人冠狀病毒229EqRT-PCR引物-探針干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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人冠狀病毒229EqRT-PCR陽(yáng)性對(duì)照(1E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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使用手冊(cè) |
1份 |
1份 |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入165uL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以1E1-1E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照。如果需要RNA陽(yáng)性樣品，需要另外訂購(gòu)。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在6號(hào)管中加入5 μL 1E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5μL 1E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號(hào)管中加入5 μL 1E5拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
樣品RNA的制備
7. 如果有N個(gè)樣品，最好設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用10μL上步所得4號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次樣本制備所要求的起始樣本體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)RNA提取試劑盒兼容，也可以選購(gòu)本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應(yīng)20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行
如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)RT-PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于RT-PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)RT-PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于RT-PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于RT-PCR陽(yáng)性對(duì)照（直接用第6步第4號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果樣本制備陽(yáng)性對(duì)照或PCR陽(yáng)性對(duì)照(包括標(biāo)曲樣本)結(jié)果為陰性，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重新樣本制備，重新進(jìn)行PCR擴(kuò)增或跟廠家聯(lián)系。如果樣本制備陰性對(duì)照或PCR陰性對(duì)照結(jié)果為陽(yáng)性，說明環(huán)境污染，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系。
2. 如果陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照均正常，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須沒有讀數(shù)，或者大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于40。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct沒有讀數(shù)、大于或等于40則均為陰性，如果小于40則為陽(yáng)性。
自備試劑
樣品RNA
樣品RNA
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期2年
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期2年
