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人腺病毒D74型探針法qPCR試劑盒
產(chǎn)品及特點
人腺病毒D74型(Human Adenovirus 74，HAdV-74)屬于人腺病毒的一種，人腺病毒屬于腺病毒科哺乳動物腺病毒屬，是無包膜的呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)的線性雙鏈DNA 病毒，基因組大小約34 kb~36 kb。根據(jù)生物學(xué)特性、血清中和實驗以及全基因組序列征，國際病毒分類委員會將其劃分為7個亞屬（HAdV?A~G），104個血清型，不同血清型對人體各器官的感染性表現(xiàn)出很大差異。D亞屬腺病毒所包含病毒占比。人腺病毒D74型主要導(dǎo)致結(jié)膜系統(tǒng)感染，如角膜炎和結(jié)膜炎等，主要臨床表現(xiàn)是嚴(yán)重雙側(cè)結(jié)膜炎伴有實質(zhì)性角膜受累，眼瞼水腫，畏光，流淚等，傳染性強，其傳播嚴(yán)重影響人類身體健康，因此快速檢測人腺病毒D74型具有重要的意義。為此，本公司以探針法qPCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)了人腺病毒D74型的檢測試劑盒，它具有下列特點：
人腺病毒D74型(Human Adenovirus 74，HAdV-74)屬于人腺病毒的一種，人腺病毒屬于腺病毒科哺乳動物腺病毒屬，是無包膜的呈二十面體對稱結(jié)構(gòu)的線性雙鏈DNA 病毒，基因組大小約34 kb~36 kb。根據(jù)生物學(xué)特性、血清中和實驗以及全基因組序列征，國際病毒分類委員會將其劃分為7個亞屬（HAdV?A~G），104個血清型，不同血清型對人體各器官的感染性表現(xiàn)出很大差異。D亞屬腺病毒所包含病毒占比。人腺病毒D74型主要導(dǎo)致結(jié)膜系統(tǒng)感染，如角膜炎和結(jié)膜炎等，主要臨床表現(xiàn)是嚴(yán)重雙側(cè)結(jié)膜炎伴有實質(zhì)性角膜受累，眼瞼水腫，畏光，流淚等，傳染性強，其傳播嚴(yán)重影響人類身體健康，因此快速檢測人腺病毒D74型具有重要的意義。為此，本公司以探針法qPCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)了人腺病毒D74型的檢測試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏度高，可以達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)人腺病毒D74型DNA高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級。
6. 本產(chǎn)品足夠50次20 μL體系的探針法qPCR反應(yīng)。
7. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
0.5mL |
0.5mL本色管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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超純水 |
1mL |
1.5mL藍(lán)蓋管 |
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人腺病毒D74型qPCR引物-探針干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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人腺病毒D74型qPCR陽性對照(1E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
1份 |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入165uL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記6個離心管，分別為6、5、4、3、2、1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3. 在6號管中加入5 μL 1E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
樣品DNA的制備
7. 如果有N個樣品，設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0 μL上步所得第4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次樣本制備所要求的起始樣本體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)DNA提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應(yīng)20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果樣本制備陽性對照或PCR陽性對照(包括標(biāo)曲樣本)結(jié)果為陰性，則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重新樣本制備，重新進(jìn)行PCR擴增或跟廠家聯(lián)系。如果樣本制備陰性對照或PCR陰性對照結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系。
2. 如果陰性對照和陽性對照均正常，則實驗有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須沒有讀數(shù)，或者大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于40。對待測樣品，如果其Ct沒有讀數(shù)、大于或等于40則均為陰性，如果小于40則為陽性。
自備試劑
樣品DNA，超純水，核酸純化試劑盒
樣品DNA，超純水，核酸純化試劑盒
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
