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西尼羅病毒探針法qRT-PCR試劑盒
產(chǎn)品及特點
西尼羅病毒（West Nile Virus，WNV）為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約11000nt。西尼羅病毒主要通過蚊媒傳播，該病毒被認(rèn)為在蚊-鳥-蚊的傳播循環(huán)過程中增殖，多數(shù)種類的鳥類和蚊類都支持病毒的復(fù)制，而且大部分鳥類在感染后并不出現(xiàn)明顯的癥狀。人和馬被認(rèn)為是西尼羅病毒的終末宿主，哺乳動物感染西尼羅病毒后可出現(xiàn)不同程度和不同癥狀的臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重的將影響神經(jīng)系統(tǒng)，引起西尼羅腦炎。西尼羅病毒的傳播影響人和多種動物健康，因此快速檢測西尼羅病毒具有重要意義。本產(chǎn)品是以探針法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測西尼羅病毒的試劑盒，它具有下列特點：
產(chǎn)品及特點
西尼羅病毒（West Nile Virus，WNV）為單股正鏈RNA病毒，基因組全長約11000nt。西尼羅病毒主要通過蚊媒傳播，該病毒被認(rèn)為在蚊-鳥-蚊的傳播循環(huán)過程中增殖，多數(shù)種類的鳥類和蚊類都支持病毒的復(fù)制，而且大部分鳥類在感染后并不出現(xiàn)明顯的癥狀。人和馬被認(rèn)為是西尼羅病毒的終末宿主，哺乳動物感染西尼羅病毒后可出現(xiàn)不同程度和不同癥狀的臨床表現(xiàn)，嚴(yán)重的將影響神經(jīng)系統(tǒng)，引起西尼羅腦炎。西尼羅病毒的傳播影響人和多種動物健康，因此快速檢測西尼羅病毒具有重要意義。本產(chǎn)品是以探針法熒光定量PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測西尼羅病毒的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)西尼羅病毒毒RNA高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5
個數(shù)量級。
6. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng)。
7. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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探針法qRT-PCR緩沖液 |
0.5mL |
0.5mL藍(lán)蓋管 |
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探針法qRT-PCR酶混合液v2 |
50μL |
0.5mL紅蓋管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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西尼羅病毒探針法引物-探針干粉 |
50次 |
0.5mL白蓋管 |
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西尼羅病毒陽性對照(1×10E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針混合干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入165μL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同。
3. 在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
樣品RNA的制備
7. 如果有N個樣品，設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0 μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。
8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qRT-PCR反應(yīng)20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），1個用于RT-PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果擴(kuò)增陽性對照或制備陽性對照結(jié)果為陰性，則整個擴(kuò)增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴(kuò)增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴(kuò)增陰性對照或制備陰性對照結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個擴(kuò)增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系，購買新的引物和探針。
2. 如果陰性對照和陽性對照正常，則實驗有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照必須無Ct或Ct大于或等于35。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于35，否則實驗無效。如果實驗有效，則分析待測樣品，如果無Ct或Ct大于或等于35，則為陰性。如果Ct小于35則為陽性。
自備試劑
樣品RNA
樣品RNA
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
