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猴痘病毒探針法qPCR試劑盒
產(chǎn)品及特點
猴痘病毒（Monkeypox Virus）屬正痘病毒屬，可在非洲綠猴腎細胞中培養(yǎng)生長，導(dǎo)致細胞病變。人類感染猴痘，主要通過被已感染的動物咬傷，或直接接觸被感染動物的血液、體液、猴痘病損而受染；通常由動物傳給人，偶也可以發(fā)生人到人的猴痘傳播。一般認為是在直接的、長時間面對面的接觸中，通過含毒的大量呼吸飛沫而傳播。猴痘還可以通過直接接觸感染者的體液或病毒污染的物品（如衣服和被褥）而傳播。主要臨床癥狀為發(fā)熱、劇烈頭痛、淋巴結(jié)腫大、背痛、肌肉痛（肌肉疼痛）以及倍感無力（精神不振）。因此快速檢測猴痘病毒具有重要的意義。
猴痘病毒（Monkeypox Virus）屬正痘病毒屬，可在非洲綠猴腎細胞中培養(yǎng)生長，導(dǎo)致細胞病變。人類感染猴痘，主要通過被已感染的動物咬傷，或直接接觸被感染動物的血液、體液、猴痘病損而受染；通常由動物傳給人，偶也可以發(fā)生人到人的猴痘傳播。一般認為是在直接的、長時間面對面的接觸中，通過含毒的大量呼吸飛沫而傳播。猴痘還可以通過直接接觸感染者的體液或病毒污染的物品（如衣服和被褥）而傳播。主要臨床癥狀為發(fā)熱、劇烈頭痛、淋巴結(jié)腫大、背痛、肌肉痛（肌肉疼痛）以及倍感無力（精神不振）。因此快速檢測猴痘病毒具有重要的意義。
本產(chǎn)品就是以探針法qPCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測猴痘病毒的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達到100拷貝/μL。
3. 提供陽性對照和內(nèi)參，便于排除假陰性結(jié)果。
4. 特異性高，引物是根據(jù)猴痘病毒高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5各數(shù)量級。
6. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法PCR反應(yīng)。
7. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
0.5mL |
0.5mL本色管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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猴痘病毒PCR引物-探針混合液（含內(nèi)參探針） |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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猴痘病毒PCR陽性對照(1×10E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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猴痘病毒PCR內(nèi)參(1×10E4拷貝/μL) |
250μL |
0.5mL白蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入200μL超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋含內(nèi)參的標準曲線樣品以陽性對照10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度和內(nèi)參固定在10E3拷貝/μL為例
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。
稀釋含內(nèi)參的標準曲線樣品以陽性對照10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度和內(nèi)參固定在10E3拷貝/μL為例
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。
1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1，0。
2. 在0號管中加入280μL熒光PCR專用模板稀釋液，35μL本試劑盒提供的內(nèi)參，震蕩一分鐘混勻。
3. 用帶芯槍頭分別將上步得到的混合液按45μL/管加入到標記的1-6號管中，用帶芯槍頭（下同）。
4. 在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線陽性樣品，每個樣品中內(nèi)參的濃度固定為10E3拷貝/μL。放冰上待用。
樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品，設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。在所有樣本中加入5uL 本試劑盒提供的內(nèi)參（共50000拷貝）。
9. 用自選方法純化樣品的DNA（含內(nèi)參），本試劑盒跟市場上大多數(shù)DNA提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應(yīng)20μL體系，在樣品制備室進行
10. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果擴增陽性對照或制備陽性對照結(jié)果為陰性，則整個擴增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴增陰性對照或制備陰性對照結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個擴增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系，購買新的引物和探針。對任何陰性樣品，如果內(nèi)參無Ct，則此樣品的陰性結(jié)果無效，此樣品需要重復(fù)實驗。
2. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，分別以陽性對照（FAM通道）和內(nèi)參（HEX通道）的Ct值為縱軸，繪制標準曲線，陽性對照的標準曲線為斜線，r2必須大于0.95，內(nèi)參的標準曲線為一條跟X軸平行的橫線。再以待測樣品的Ct值從陽性對照的標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
3. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照FAM通道的Ct必須大于或等于40。陽性對照FAM通道的熒光信號必須有對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于35。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。對任何FAM通道結(jié)果為陰性的樣品，如果其對應(yīng)的內(nèi)參HEX通道無Ct，則此樣品的陰性結(jié)果無效，此樣品需要重復(fù)實驗。
自備試劑
樣品DNA
樣品DNA
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
