甲型流感病毒H16N5亞型雙重探針?lè)╭RT-PCR檢測(cè)及分型試劑盒

產(chǎn)品及特點(diǎn)
甲型流感病毒(Influenza A Virus)是常見(jiàn)流感病毒(簡(jiǎn)稱(chēng)禽流感)，甲型流感病毒某些亞型，如H16N5亞型，可以引起急性呼吸道傳染病，即甲型流感，其癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數(shù)伴有嚴(yán)重的肺炎，嚴(yán)重者心、腎等多種臟器衰竭導(dǎo)致死亡，病死率很高。此病可通過(guò)消化道、呼吸道、皮膚損傷和眼結(jié)膜等多種途徑傳播，嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，因此快速檢測(cè)甲型流感H16N5亞型具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針?lè)╭PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專(zhuān)門(mén)檢測(cè)甲型流感H16N5亞型的試劑盒,它具有下列特點(diǎn)：

1. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。

2. 引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。

3. 提供陽(yáng)性對(duì)照和內(nèi)參，便于排除假陰性結(jié)果。

4. 特異性高，引物是根據(jù)甲型流感H16N5病毒RNA高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5各數(shù)量級(jí)。

6. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針?lè)╭RT-PCR反應(yīng)。

7. 本產(chǎn)品只能用于科研。

規(guī)格及成分

成分	規(guī)格	包裝
探針?lè)?/span>qRT-PCR緩沖液	500μL	0.5mL藍(lán)蓋管
探針?lè)?/span>qRT-PCR酶混合液v2	50μL	0.5mL紅蓋管
熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液	1mL	1.5mL綠蓋管
H16N5亞型qRT-PCR引物-探針干粉（含內(nèi)參探針	50次	0.5mL棕色管
H16亞型qRT-PCR陽(yáng)性對(duì)照(1×10E7拷貝/μL)	50μL	0.5mL黃蓋管
N5亞型qRT-PCR陽(yáng)性對(duì)照(1×10E7拷貝/μL)	50μL	0.5 mL白蓋管
人基因組DNA內(nèi)參陽(yáng)性對(duì)照(1×10E4拷貝/μL)	50μL	0.5mL橙蓋管
使用手冊(cè)	1份	無(wú)
本產(chǎn)品采用十一孔盒包裝
注意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入216uL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。

使用方法
稀釋含內(nèi)參的H16標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，是否做H16標(biāo)曲由客戶決定

1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為A6，A5，A4，A3，A2，A1，A0。

2. 在A0號(hào)管中加入280μL熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液，35μL本試劑盒提供的人基因組DNA內(nèi)參（35000拷貝），震蕩一分鐘混勻。內(nèi)參濃度為1111拷貝/μL。

3. 用帶芯槍頭分別將上步得到的混合液按45μL/管加入到標(biāo)記的A1-A6號(hào)管中，用帶芯槍頭（下同）。

4. 在A6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的H16陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的H16標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，內(nèi)參濃度為1000拷貝/μL。放冰上待用。

5. 換槍頭，在A5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的H16標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，內(nèi)參濃度為1000拷貝/μL。放冰上待用。

6. 換槍頭，在A4號(hào)管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的H16標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，內(nèi)參濃度為1000拷貝/μL。放冰上待用。

稀釋含內(nèi)參的N5標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品，是否做N5標(biāo)曲由客戶決定

7. 操作同上，只是使用N5的PC作為模板。得到6個(gè)濃度的樣本放冰上待用，內(nèi)參濃度均為1000拷貝/μL，分別是B1-B6。

樣品RNA的制備

8. 用自選方法純化N個(gè)樣品的RNA。由于本試劑盒的這個(gè)版本只提供DNA作為內(nèi)參，因此不能監(jiān)控純化過(guò)程。

Probe qRT-PCR反應(yīng)本試劑提供的內(nèi)參為DNA，只能監(jiān)控PCR過(guò)程

9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+1+6+6個(gè)RT-PCR管，其中N個(gè)管用于上步得到的N個(gè)樣品，1個(gè)用于RT-PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于H16的標(biāo)準(zhǔn)曲線，另外6個(gè)用于N5的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+3個(gè)RT-PCR管，其中N個(gè)管用于上步得到的N個(gè)樣品，1個(gè)用于RT-PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于H16 RT-PCR陽(yáng)性對(duì)照，1個(gè)用于N5 RT-PCR陽(yáng)性對(duì)照（直接用第一步和第二步所得的兩個(gè)4號(hào)稀釋液作為模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

數(shù)據(jù)處理

1. 如果擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果為陰性，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴(kuò)增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴(kuò)增陰性對(duì)照為陽(yáng)性，說(shuō)明環(huán)境污染，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系，購(gòu)買(mǎi)新的引物和探針。

2. 如果陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照正常，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。

3. 對(duì)定量檢測(cè)，以標(biāo)曲樣本濃度的log值為橫軸，分別以H16陽(yáng)性對(duì)照（FAM通道）和N5陽(yáng)性對(duì)照（HEX通道）的Ct值為縱軸，繪制兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2必須大于0.95。再以待測(cè)樣品的Ct值從分別從兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出對(duì)應(yīng)樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。

4. 對(duì)定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照FAM通道的Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照FAM通道的熒光信號(hào)必須有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于35。對(duì)待測(cè)樣品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40則為H16陰性，如果小于或等于35則為H16陽(yáng)性。如果其HEX通道的Ct大于或等于40則為N5陰性，如果小于或等于35則為N5陽(yáng)性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性。

5. 對(duì)H16或N5陰性樣本，如果內(nèi)參為陽(yáng)性（Texas Red熒光通道有信號(hào)，信號(hào)有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于35），則判斷為真陰性。如果內(nèi)參為陰性（TET熒光通道沒(méi)有信號(hào)，信號(hào)沒(méi)有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，沒(méi)有典型擴(kuò)增曲線，Ct值大于35），則不能判斷，本樣本需要重復(fù)。對(duì)H16或N5陽(yáng)性樣本，不需要分析內(nèi)參的結(jié)果。

自備試劑
樣品RNA

運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期2年

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