在現(xiàn)代生物技術(shù)中，酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA) 被廣泛用于確定生物樣品中抗原、抗體、肽、蛋白質(zhì)、激素或其他生物分子的存在和數(shù)量。由于其靈敏度高，它可以識別出甚至最小的抗原濃度。

  

  ELISA 的敏感性歸因于其識別單個抗原抗體復(fù)合物之間相互作用的能力。

  

  Elisa 試劑盒在不斷變化的醫(yī)學(xué)研究和診斷領(lǐng)域 中至關(guān)重要。由于其卓越的準(zhǔn)確性和適應(yīng)性，這些試劑盒對于解決醫(yī)學(xué)難題和研究新療法至關(guān)重要。隨著科學(xué)好奇心和技術(shù)進(jìn)步，它們的用途已擴(kuò)展到從傳染病到癌癥生物標(biāo)志物識別等各個領(lǐng)域。它們每天都在開辟新天地，幫助改善患者護(hù)理并實現(xiàn)革命性的醫(yī)學(xué)進(jìn)步。

  

  認(rèn)識ELISA

  

  “酶聯(lián)免疫吸附測定法”或簡稱“ELISA”于 1971 年首次使用，指用于測量抗原濃度的酶基免疫測定技術(shù)。酶聯(lián)免疫吸附測定 (ELISA) 試劑盒用于研究檢測和量化樣本內(nèi)的特定蛋白質(zhì)序列和其他靶標(biāo)。使用正確的ELISA 試劑盒 可提供精確、可量化的數(shù)據(jù)，以確認(rèn)和支持您的研究。在科研實驗項目選擇適當(dāng)?shù)脑噭┖蓄愋停ㄖ苯?、間接、夾心或競爭性 ELISA）。高質(zhì)量的ELISA試劑盒經(jīng)過精心設(shè)計，能夠容忍一定的技術(shù)差異，并幫助您獲得更準(zhǔn)確、可靠的實驗結(jié)果。

  

  ELISA 試劑盒在細(xì)胞因子檢測中的應(yīng)用

  

  ELISA 技術(shù)包括多種免疫測定方法，不同的方法在具體步驟和應(yīng)用場景上有所差異。幾種關(guān)鍵參數(shù)，例如要檢測的抗原類型、針對特定抗原的單克隆抗體以及必要的測試靈敏度，決定了應(yīng)采用哪種類型的 ELISA。夾心 ELISA 由于具有高靈敏度和特異性，在細(xì)胞因子檢測中應(yīng)用廣泛。間接ELISA 也是常用的方法之一。

  

  1. 夾心 ELISA

  

  細(xì)胞因子夾心 ELISA 是一種靈敏的酶聯(lián)免疫測定法，可以精確識別和測量可溶性趨化因子和細(xì)胞因子蛋白的量?；炯?xì)胞因子夾心 ELISA 方法使用高純度的抗細(xì)胞因子抗體（捕獲抗體）。這些抗體非共價吸附在塑料微孔板上。固定化抗體可選擇性地結(jié)合洗板后加入板中的樣品中的可溶性細(xì)胞因子蛋白。

  

  去除未結(jié)合的物質(zhì)后，使用生物素偶聯(lián)的抗細(xì)胞因子抗體（檢測抗體）來識別已收集的細(xì)胞因子蛋白。隨后是酶標(biāo)記的親和素或鏈霉親和素步驟。

  

  ELISA 讀數(shù)儀 可 用于在添加顯色底物后，以可接受的光密度 (OD) 分光光度法簡單地量化結(jié)合的酶聯(lián)檢測試劑產(chǎn)生的有色產(chǎn)物的量。當(dāng)板讀數(shù)儀與計算機(jī)連接時，數(shù)據(jù)存儲和重新分析變得更加容易。

  

  ELISA 夾心法 是測量分析物時獲得高精度的首選方法。這種方法可以揭示分析物的特異性和靈敏度，首先使用捕獲抗體固定分析物。當(dāng)添加帶有酶標(biāo)記的檢測抗體時，夾心結(jié)構(gòu)就像積木一樣組裝起來。它通過識別分析物上的另一個表位來完成復(fù)雜的夾心結(jié)構(gòu)。

  

  2. 間接 ELISA

  

  間接 ELISA 是一種利用二抗識別一抗抗原特異性抗體的方法。間接ELISA中，二抗的標(biāo)記酶和二抗的親和力可以影響靈敏度和信號放大。兩種抗體在這種配置下共同作用，增強(qiáng)信號并提高靈敏度，使分析物更容易被檢測到。

  

  一抗具有高特異性，可以特異性識別分析物，并與之形成牢固的結(jié)合。然后，二抗通過其與一抗的結(jié)合位點特異性識別并結(jié)合到一抗上。二抗通常被標(biāo)記上酶，例如辣根過氧化物酶（HRP），當(dāng)加入底物時，酶會催化底物反應(yīng)，產(chǎn)生顏色變化或化學(xué)發(fā)光信號，從而實現(xiàn)分析物的檢測。

  

  間接ELISA在檢測細(xì)胞因子時靈敏度通常較高，這主要是因為二抗的標(biāo)記酶可以放大信號，從而提高檢測靈敏度。間接ELISA的靈敏度取決于多種因素，包括一抗的親和力和特異性、二抗的親和力和標(biāo)記酶的活性、底物的敏感性和穩(wěn)定性以及實驗操作的規(guī)范性。

  

  此外，一種酶偶聯(lián)的二抗可以識別來自同一物種的多種一抗。這為用戶提供了根據(jù)需要在檢測不同抗原的幾種ELISA中使用相同的酶偶聯(lián)二抗的選擇，但前提是這些抗原來自同一物種，并且二抗能夠識別這些抗原。相關(guān)閱讀：《elisa試劑盒有哪幾種類型？elisa四類型圖解》

  

  選擇合適的 ELISA 試劑盒

  

  考慮以下幾點將有助于您的 ELISA 試劑盒發(fā)揮最佳作用：

  

  1.抗體的特異性

  

  ELISA 測試中抗體的選擇 取決于特異性和親和力標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)定義，單克隆抗體結(jié)合更精確，可降低背景信號。多克隆抗體和單克隆抗體可以一起使用或單獨使用。雖然多克隆抗體會產(chǎn)生更高的信號，但非特異性結(jié)合也會更普遍。每次還需要進(jìn)行廣泛的測試，因為多克隆抗體會表現(xiàn)出更多的批次間差異。

  

  術(shù)語“匹配對”描述的是您在實驗中用來檢測單一抗原的單克隆抗體、多克隆抗體或兩種抗體的混合物。這些抗體應(yīng)該已被證明能夠通過結(jié)合多個表位并作為有效的“捕獲”和“檢測”對發(fā)揮良好作用。

  

  2. 靈敏度和檢測范圍

  

  每種 ELISA 試劑盒都旨在檢測不同的靶標(biāo)，并具有獨特的功能；它們并非普遍適用。了解您的 ELISA 試劑盒的靈敏度和特異性，以及每個步驟的精確增強(qiáng)，將提供準(zhǔn)確可靠的標(biāo)準(zhǔn)曲線，顯示您的靶標(biāo)的測量值。

  

  每個包裝中都會包含針對每個目標(biāo)量身定制的試劑和 ELISA 緩沖液。在測試開始時，請確保您了解每組參數(shù)，例如抗體類型、孵育時間、溫度和報告系統(tǒng)。如果您事先熟悉這些參數(shù)，這將為您節(jié)省大量時間和煩惱。

  

  3. 樣本兼容性

  

  了解特定 ELISA 試劑盒是否與樣本（基質(zhì)）的組成兼容（或不兼容）。試劑盒的性能通常使用各種基質(zhì)進(jìn)行評估，結(jié)果通常顯示在說明書和其他支持材料中。確保您知道 ELISA 試劑盒在樣本（尿液、組織培養(yǎng)、血漿、血清等）基質(zhì)中的描述有多詳盡。雖然這并不一定意味著試劑盒不起作用，但它將有助于了解您是否需要更多的驗證試驗來確定它在您感興趣的基質(zhì)中的表現(xiàn)如何。

  

  4. 驗證和質(zhì)量控制

  

  使用不同稀釋度的對照樣品進(jìn)行一些測試以生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，并充分利用您的試劑盒。保存您最好的樣品，等您知道要使用的適當(dāng)稀釋度時再使用。了解要使用的樣品和稀釋度后，您可以最有效地安排您的板。確保您使用所有孔，并遵守試劑盒的說明。如果根據(jù)給出的信息需要額外的檢測試劑，請?zhí)砑铀?/span>

  

  實驗方案

  

  生成有價值且有意義的數(shù)據(jù)時，應(yīng)力求準(zhǔn)確和可重復(fù)。始終牢記 ELISA 協(xié)議，以確保一致性、最佳性能和精確結(jié)果。以下是需要考慮的實驗協(xié)議：

  

  1.在開始實驗之前，讓試劑盒試劑約 30 分鐘達(dá)到室溫或指定溫度。

  

  2.冷凍樣品必須完全解凍，并且凍融循環(huán)次數(shù)應(yīng)保持最少 - 不超過三次。

  

  3.在實驗期間和實驗之間保持一致的環(huán)境條件，例如溫度和濕度。

  

  4.確保每件設(shè)備（例如讀取器、洗板機(jī)和移液器）都經(jīng)過校準(zhǔn)。

  

  5.使用足量的抗體。

  

  6.使用新鮮配制的底物溶液，而不是在使用前將其儲存數(shù)小時。

  

  7.在測試期間，一致地處理樣本并遵守相同的協(xié)議。

  

  8.操作過程中目視檢查吸頭和孔，確保吸液、試劑添加和取出準(zhǔn)確。液位應(yīng)相同。

  

  9.為了保證ELISA檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性，請勿混合不同批次或不同品牌的試劑。每個ELISA試劑盒的組裝方式是使各個組件作為一個整體發(fā)揮作用，在檢測之間進(jìn)行大量混合可能會對結(jié)果產(chǎn)生負(fù)面影響，例如影響反應(yīng)靈敏度、特異性等。

  

  10.試劑使用后絕不可放回瓶中。

  

  11.測試后，請將托盤關(guān)閉以防止孔變干。

  

  成功檢測細(xì)胞因子的秘訣

  

  1. 樣品制備

  

  在開始主要實驗之前，請使用少量樣本確定適當(dāng)?shù)南♂尫秶Ｄ臉颖颈仨毰c微量滴定板測試的格式兼容。所檢查的生物標(biāo)記物的數(shù)量總是會有所不同。

  

  由于您要尋找符合樣品標(biāo)準(zhǔn)曲線的數(shù)據(jù)，因此請使用試劑盒的說明作為指南。請注意，含有膽紅素或其他干擾因素的樣品會導(dǎo)致錯誤的發(fā)現(xiàn)。以下樣品可與 ELISA 試劑盒一起使用：細(xì)胞裂解物、血清、唾液、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清液。

  

  2. 已知濃度的滴定標(biāo)準(zhǔn)品

  

  已確定濃度的滴定 ELISA 標(biāo)準(zhǔn)對于任何 ELISA 都是必不可少的，因為它們使用戶能夠確定測試樣品中的抗原濃度。為了創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，通常留出一系列孔，并將已知量的純化重組蛋白逐漸添加到孔中。

  

  然后，用戶可以從微孔板讀數(shù)儀中獲取已知蛋白質(zhì)濃度的一組參考吸光度值，以便在這些孔與測試樣品同時處理時與測試樣品的吸光度值相匹配。

  

  之后，您可以計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，以此來比較測試樣本以確定所需蛋白質(zhì)的濃度。用戶稀釋的準(zhǔn)確度也可以通過標(biāo)準(zhǔn)曲線來驗證。

  

  3. 添加底物

  

  孔中的酶量與ELISA 底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的量直接相關(guān)。最常見的附著在抗體上的酶是堿性磷酸酶 (AP) 和辣根過氧化物酶 (HRP)?？梢约僭O(shè)，針對每種酶定制的各種底物都可以產(chǎn)生熒光或顯色產(chǎn)物。

  

  此外，底物的敏感性各不相同，這可能會提高檢測的總敏感性。在選擇合適的底物和酶聯(lián)抗體時，還必須考慮實驗結(jié)束時讀取 ELISA 板的設(shè)備。

  

  4.檢測與分析

  

  確定 ELISA 靈敏度的一種傳統(tǒng)方法是選擇產(chǎn)生的信號至少比平均背景信號值高出兩個或三個標(biāo)準(zhǔn)差的最低細(xì)胞因子濃度。

  

  特定細(xì)胞因子和趨化因子蛋白存在于混合細(xì)胞因子環(huán)境中，例如受刺激的淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清液。因此，夾心 ELISA 可以量化這些蛋白質(zhì)的生理相關(guān)量，這是由于檢測抗體信號的酶介導(dǎo)擴(kuò)增。

  

  如何分析 ELISA 數(shù)據(jù)

  

  1. 結(jié)果計算

  

  在 ELISA 過程中，通過將未知樣本的值與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較來確定未知樣本的值。在樣本稀釋的情況下，稀釋倍數(shù)需要乘以從標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得的濃度值。ELISA 樣本應(yīng)始終重復(fù)三次或兩次，以提供具有足夠數(shù)據(jù)的結(jié)果來進(jìn)行統(tǒng)計驗證。

  

  對于每個標(biāo)準(zhǔn)、對照和樣品，計算兩次或三次測量的平均值，并扣除平均零標(biāo)準(zhǔn)光密度 (OD)。重復(fù)數(shù)據(jù)的變異系數(shù) (CV) 不應(yīng)超過 20%。

  

  2. 標(biāo)準(zhǔn)曲線

  

  使用計算機(jī)軟件繪制平均吸光度與蛋白質(zhì)濃度的關(guān)系，以創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。確保遵循ELISA 測試協(xié)議建議的數(shù)據(jù)縮減技術(shù)。

  

  將已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞因子蛋白溶液連續(xù)稀釋，以創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并將其添加到夾心 ELISA 測試中。這些標(biāo)準(zhǔn)曲線也稱為“校準(zhǔn)曲線”。它們通常是通過將標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞因子蛋白濃度（通常以 ng 或 pg 細(xì)胞因子/ml 表示）與相應(yīng)的重復(fù)平均 OD 值作圖來制作的。

  

  可以從標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷出疑似含有細(xì)胞因子的樣本的濃度。ELISA 計算機(jī)軟件程序可幫助完成此操作。為確保 OD 位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性區(qū)域內(nèi)，請確保對未知樣本進(jìn)行一系列稀釋。研究人員可以選擇對其數(shù)據(jù)應(yīng)用各種曲線擬合分析，例如線性對數(shù)、對數(shù)對數(shù)或四參數(shù)轉(zhuǎn)換，具體取決于所用的 ELISA 試劑類型。

  

  如果沒有軟件，可以通過在線性尺度上繪制濃度對數(shù)與 OD 對數(shù)的圖來線性化 ELISA 數(shù)據(jù)分析?？梢允褂没貧w分析來找到最佳擬合線。此過程將產(chǎn)生足夠但不太準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)擬合。

  

  3. 計算變異系數(shù)

  

  變異系數(shù) (CV) 描述的是標(biāo)準(zhǔn)差與平均值的比率，通常以百分比表示。CV 計算至關(guān)重要，因為它可能會揭示 ELISA 數(shù)據(jù)中的任何差異或錯誤。重復(fù)數(shù)據(jù)的變異系數(shù) (CV) 不應(yīng)超過 20%。較高的 CV 表示不準(zhǔn)確和潛在錯誤較多。

  

  ELISA 常見問題的排除

  

  每種 ELISA 都有某些缺點。首先，存在一個問題，即測試樣品中存在多少目標(biāo)蛋白質(zhì)。如果數(shù)量過高或過低，微孔板讀數(shù)器產(chǎn)生的吸光度讀數(shù)可能分別超出或低于標(biāo)準(zhǔn)曲線的限值。因此，估計測試樣品中蛋白質(zhì)的精確數(shù)量將具有挑戰(zhàn)性。

  

  如果讀數(shù)非常高，在將測試樣品放入板孔之前先稀釋它。根據(jù)稀釋倍數(shù)，必須修改最終數(shù)字。DIY 試劑盒有時需要仔細(xì)優(yōu)化抗體濃度以獲得良好的信噪比。

  

  如今 ELISA 技術(shù)已被改進(jìn)以量化不同實驗樣本中的抗原水平。然而，它們背后的基本思想是相同的。在選擇是否采用間接或夾心 ELISA 進(jìn)行細(xì)胞因子檢測時，待檢測樣本的復(fù)雜程度和抗原特異性抗體的可用性是至關(guān)重要的考慮因素。

  

  當(dāng)確定免疫反應(yīng)的結(jié)果（例如確定樣本中抗體的含量）時，可以使用間接 ELISA。當(dāng)檢查復(fù)雜樣本時，如果分析物或靶抗原存在于混合樣本中（如組織裂解物或培養(yǎng)上清液），夾心 ELISA 是最合適的方法。