一、基本原理
通過抗原與抗體的特異性免疫反應(yīng)將待測物與酶連接，然后通過酶與底物產(chǎn)生顏色反應(yīng)，用于定量測定。測定的對象可以是抗原也可以是抗體。
ELISA 的基礎(chǔ)是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結(jié)合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本(測定其中的抗體或抗原)與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。
   用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復合物與液體中的其他物質(zhì)分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應(yīng)而結(jié)合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質(zhì)的量呈一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化水解或氧化還原反應(yīng)而成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)呈色的深淺進行定性或定量分析。         由于酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應(yīng)的結(jié)果，使測定方法達到很高的敏感度。
所生成有色產(chǎn)物的顏色深淺與欲測的抗原(抗體)含量成正比。 這種有色產(chǎn)物可用肉眼、光學顯微鏡、電子顯微鏡觀察，也可以用分光光度計(酶標儀)加以測定。其方法簡單，方便迅速，特異性強。
二、ELISA實驗方法
ELISA根據(jù)不同的設(shè)計可以分為直接法、間接法、夾心法和競爭法。
1.直接ELISA：降抗原通過吸附等方法直接固定在固相載體上，經(jīng)過洗滌后，加入酶偶聯(lián)的的檢測抗體結(jié)合。然后加入底物，酶催化底物產(chǎn)生與待測抗原的量成正比的顯色信號。直接ELISA常用于評估抗體的親和力和特異性、研究阻斷/抑制相互作用。直接ELISA具有快速、操作簡單的特點，但由于僅使用一種抗體，特異性較低，可能會產(chǎn)生較高的背景信號。
2.間接ELISA：將抗原通過吸附等方法直接固定在固相載體上，經(jīng)過洗滌后，先添加能與抗原特異性結(jié)合的一抗進行孵育，再次清洗后，通過添加對一抗種屬具有特異性的酶偶聯(lián)的二抗來檢測結(jié)合的一抗。在底物的存在下，酶催化底物產(chǎn)生與待測抗原的量成正比的顯色信號。間接ELISA是直接ELISA的基礎(chǔ)上加入在酶標記的二抗進行檢測的一種常見形式，常用于內(nèi)源性抗體的檢測。間接ELISA利用二抗進行了擴增，特異性較直接ELISA好，但二抗可能會引起交叉反應(yīng)。
3.夾心ELISA：夾心ELISA是最常見的ELISA類型。兩種特異性抗體用于夾住抗原，通常稱為匹配抗體對。將捕獲抗體包被在固相載體上，清洗掉多余未結(jié)合的捕獲抗體后，加入樣品，樣品中的目標抗原被特異性捕獲。再次清洗后，產(chǎn)生與樣品中存在的目標抗原的量成正比的信號。夾心ELISA需要兩種抗體才能與目標抗原結(jié)合，具有高度特異性，能與復雜的樣本基質(zhì)兼容，常用于生物樣本中目標抗原的濃度檢測，但操作步驟較為繁瑣。
4.競爭性ELISA：與夾心ELISA類似，捕獲抗體包被在固相載體上。不使用酶偶聯(lián)的檢測抗體，而是使用酶偶聯(lián)的抗原與樣品中的目標抗原競爭性與捕獲抗體結(jié)合。樣本中存在的目標抗原越多，與捕獲抗體結(jié)合的酶偶聯(lián)抗原就越少。加入底物后，產(chǎn)生的信號與樣品中存在的目標抗原的量成反比。競爭性ELISA通常用于目標抗原太小而無法有效的與兩種抗體形成夾心的情況，如小分子和激素的濃度測定。競爭性ELISA只使用一種抗體，相對于夾心ELISA的特異性較低，并且需要偶聯(lián)抗原。
三、注意事項：
1.正式試驗時，應(yīng)分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應(yīng)作一式二份，以保證實驗結(jié)果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應(yīng)，可采用羊血清、兔血清或BSA等封閉。
2.在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:
(1)固相載體的選擇：許多物質(zhì)可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應(yīng)，觀察其顯色反應(yīng)是否均一性，據(jù)此判明其吸附性能是否良好。
(2)包被抗體(或抗原)的選擇：將抗體(或抗原)吸附在固相載體表面時，要求純度要好,吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響,一般多采用4℃18～24小時。蛋白質(zhì)包被的最適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質(zhì)濃度(0.1、1.0和10μg／ml等)進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對于多數(shù)蛋白質(zhì)來說通常為1～10μg／ml。
(3)酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定(見酶標記抗體部份)。然后再固定其它條件或采取“方陣法”(包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度)在正式實驗系統(tǒng)里準確地滴定其工作濃度。

(4 ) 酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應(yīng)，而本身無色。有些供氫體(如OPD等)有潛在的致癌作用，應(yīng)注意防護。有條件者應(yīng)使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應(yīng)加入強酸或強堿以終止反應(yīng)。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。

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