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蓖麻毒素(RIC)ELISA試劑盒
簡(jiǎn)介
蓖麻是大戟科蓖麻屬植物，是重要的油料作物，除蓖麻油外，其種子含有大量的蓖麻毒素。蓖麻毒素系指蓖麻毒蛋白、蓖麻堿、蓖麻變應(yīng)原和血球凝集素四種毒性物質(zhì)，其中蓖麻毒蛋白的毒性最大。在藥物研究中，蓖麻毒蛋白又稱(chēng)蓖麻毒素，為具有兩條肽鏈的高毒性的植物蛋白；它易損傷肝、腎等實(shí)質(zhì)器官，發(fā)生出血、變性、壞死病變，并能凝集和溶解紅細(xì)胞，抑制麻痹心血管和呼吸中樞，是致死的主要原因之一。
本試劑盒蓖麻毒素免疫測(cè)定是一種兩步法90分鐘固相ELISA，用于測(cè)量細(xì)胞培養(yǎng)上清液、血清和血漿中的蓖麻毒素。試劑盒包含大腸桿菌表達(dá)重組蓖麻毒素和針對(duì)重組蛋白產(chǎn)生的抗體。使用天然蓖麻毒素獲得的結(jié)果顯示出與使用重組標(biāo)準(zhǔn)品獲得的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)平行的線(xiàn)性曲線(xiàn)。這些結(jié)果表明，該試劑盒可用于測(cè)定天然蓖麻毒素的相對(duì)質(zhì)量值。
檢測(cè)原理
試劑盒采用雙抗體夾心法ELISA技術(shù):將蓖麻毒素 (RIC) 捕獲抗體包被于酶標(biāo)板上，捕獲樣品及標(biāo)準(zhǔn)品中的RIC，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗RIC抗體，與RIC結(jié)合形成“抗體-抗原-抗體-HRP”免疫復(fù)合物，加入TMB顯色后，若樣本中有RIC則顯藍(lán)色，加入終止液停止反應(yīng)。檢測(cè)過(guò)程中游離的成分均被洗去，用酶標(biāo)儀在450nm處測(cè)OD值，顏色的深淺和樣品中的蓖麻毒素 (RIC) 的含量呈正比，通過(guò)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)計(jì)算出樣本中RIC的濃度。
需要的其他材料
1. 酶標(biāo)儀，包含450nm測(cè)定波長(zhǎng)，同時(shí)包含600-680nm校正波長(zhǎng)更佳；
2. 移液器及槍頭；
3. 蒸餾水或去離子水；
4. 100-1000mL刻度量筒；
5. 洗瓶、排槍或自動(dòng)微孔板清洗機(jī)；
6. 水平軌道微孔板振蕩器，能夠保持500±50 rpm的速度；
7. 用于稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的試管。
試劑準(zhǔn)備
使用前將所有試劑置于室溫平衡30分鐘左右。
洗滌液/稀釋液配置
如果洗滌液/稀釋液（20×）有晶體析出，需在37℃下加熱?晶體全部溶解。用蒸餾水1:20稀釋?zhuān)ɡ纾?mL 濃縮洗滌液加入19mL的蒸餾水）
標(biāo)準(zhǔn)品配置
試劑盒中取出標(biāo)準(zhǔn)品，準(zhǔn)備7個(gè)試管，先將12ng/mL標(biāo)準(zhǔn)品（200uL）按需吸取一定量用1×稀釋液稀釋至640pg/mL（例：53uL的標(biāo)準(zhǔn)品母液+947uL的1×稀釋液，制備得到1000μL的640pg/mL濃度標(biāo)準(zhǔn)品），隨后在6個(gè)試管中分別加入500μL的1×稀釋液，在這6個(gè)單獨(dú)的試管中將640pg/mL標(biāo)準(zhǔn)品依次2倍倍比稀釋至6個(gè)梯度，共配制7個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，依次為： 640pg/mL，320pg/mL、160pg/mL、80pg/mL、40pg/mL、20pg/mL、10pg/mL、從最高濃度標(biāo)準(zhǔn)品溶液中吸取500μL標(biāo)準(zhǔn)品到下一個(gè)試管中，輕輕吹打混勻，以此類(lèi)推進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)品的倍比稀釋?zhuān)ㄈ鐖D所示），1×稀釋液用作零濃度標(biāo)準(zhǔn)品(0pg/mL)。
一抗工作液配置
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×一抗工作液稀釋成1×一抗工作液，根據(jù)所需用量配置。
酶標(biāo)二抗工作液配置
使用前10分鐘，用1×稀釋液將100×酶標(biāo)二抗稀釋成1×酶標(biāo)抗體工作液，根據(jù)所需用量配置。
備 注：如樣本中待測(cè)物濃度高于標(biāo)準(zhǔn)品最高值，請(qǐng)根據(jù)實(shí)際情況選擇適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù) (建議：將待測(cè)樣本用樣品稀釋液最低稀釋1倍，在正式實(shí)驗(yàn)之前做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以確定具體稀釋倍數(shù)) ；標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)二抗溶液根據(jù)實(shí)驗(yàn)所需酶標(biāo)板孔數(shù)吸取一定量配制工作液，剩余溶液應(yīng)放回-20℃儲(chǔ)存，且避免反復(fù)凍融。（若實(shí)驗(yàn)在1-2周內(nèi)做完，標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于2-8℃保存；若實(shí)驗(yàn)為長(zhǎng)時(shí)間跨度實(shí)驗(yàn)，建議將標(biāo)準(zhǔn)品母液及100×酶標(biāo)抗體置于-20℃保存，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性）
結(jié)果的計(jì)算
計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品和樣本復(fù)孔的平均OD值并減去空白孔的OD值作為校正值。以濃度為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出四參數(shù)邏輯函數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(作圖時(shí)去掉空白組的值)?；蛘呤褂媚軌蛏伤膮?shù)邏輯（4-P）曲線(xiàn)擬合的計(jì)算機(jī)軟件來(lái)創(chuàng)建標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。若樣品OD值高于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上限，應(yīng)適當(dāng)稀釋后重測(cè)并在計(jì)算樣本濃度時(shí)乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
精密度
批內(nèi)精密度 ：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在同一個(gè)板塊內(nèi)精度評(píng)估。
批內(nèi)變異系數(shù) CV%小于10%。
批間精密度 ：三組已知的高、中、低濃度樣品，進(jìn)行二十次在不同板塊內(nèi)精度評(píng)估。
批間變異系數(shù) CV%小于15%。
回收率
樣本回收率：80% - 120%
靈敏度
經(jīng)樣本測(cè)試，本試劑盒的檢測(cè)靈敏度為10 ppb。
線(xiàn)性關(guān)系
分別在選取的4份健康小鼠血清、血漿和細(xì)胞培養(yǎng)上清中加入高濃度蓖麻毒素，在標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)動(dòng)力學(xué)范圍內(nèi)進(jìn)行稀釋?zhuān)u(píng)估線(xiàn)性。
本ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)計(jì)算和曲線(xiàn)圖，請(qǐng)您下載產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)(供參考），本試劑盒僅供科研使用，不得用于臨床診斷和治療。
