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大腸桿菌總RNA殘留探針法qPCR試劑盒(不含內(nèi)參)
產(chǎn)品及特點
大腸桿菌是生物制品生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的宿主細胞之一。理論上，存在于生物制品中的微量大腸桿菌RNA殘留都可能轉(zhuǎn)導(dǎo)到人體細胞， 可能導(dǎo)致癌變或其他病理變化。因此，宿主細胞RNA殘留量的控制是生物制品質(zhì)量控制中非常重要的環(huán)節(jié)，對殘留RNA檢測具有重要的意義。為此本公司，開發(fā)了基于熒光定量RT-PCR技術(shù)的、專門用于檢測樣品中大腸桿菌總RNA殘留的本產(chǎn)品，它具有下列特點：
產(chǎn)品及特點
大腸桿菌是生物制品生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛的宿主細胞之一。理論上，存在于生物制品中的微量大腸桿菌RNA殘留都可能轉(zhuǎn)導(dǎo)到人體細胞， 可能導(dǎo)致癌變或其他病理變化。因此，宿主細胞RNA殘留量的控制是生物制品質(zhì)量控制中非常重要的環(huán)節(jié)，對殘留RNA檢測具有重要的意義。為此本公司，開發(fā)了基于熒光定量RT-PCR技術(shù)的、專門用于檢測樣品中大腸桿菌總RNA殘留的本產(chǎn)品，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達到0.001pg/μL。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物和探針是根據(jù)大腸桿菌RNA高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級。
6. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量RT-PCR反應(yīng)。
7. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
使用方法
稀釋標準曲線樣品以100pg-0.001pg/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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探針法qRT-PCR緩沖液 |
0.5mL |
0.5 mL綠蓋管 |
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探針法qRT-PCR酶混合液V2.0 |
0.5mL |
0.5mL紅蓋管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠色蓋 |
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大腸桿菌qPCR引物-探針混合液 |
150μL |
0.5mL棕色管 |
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大腸桿菌RT-PCR陽性對照(100pg/μL) |
50μL |
0.5mL黃色蓋 |
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使用手冊 |
1份 |
1份 |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入165 μL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標準曲線樣品以100pg-0.001pg/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL 熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3. 在6號管中加入5 μL 1×100pg/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10pg/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10pg/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1pg/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1pg/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得100ng/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到從100pg/μL 到1ng/μL 共6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
樣品RNA的制備
7. 如果有N個樣品，設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟核酸純化試劑盒所要求的其實樣本體積相同。NC可以用水替代。本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸純化試劑盒兼容。
Probe qRT-PCR反應(yīng)20μL體系，在樣品制備室進行
8. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），1個用于RT-PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
9. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加）：
數(shù)據(jù)處理
1. 如果擴增陽性對照(包括標曲樣本)或樣本制備陽性對照結(jié)果為陰性，則整個擴增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果RT-PCR陰性對照或樣本制備陰性對照結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個擴增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系。
2. 如果陰性對照和陽性對照正常，則實驗有效，可以進入后續(xù)分析。
3. 對定量檢測，以標曲樣本濃度的log值為橫軸，分別以陽性標準曲線樣本的Ct值（FAM通道）為縱軸，繪制標準曲線，r2必須大于0.95。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出RNA濃度的log值，再推算出RNA的濃度。
3. 對定量檢測，以標曲樣本濃度的log值為橫軸，分別以陽性標準曲線樣本的Ct值（FAM通道）為縱軸，繪制標準曲線，r2必須大于0.95。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出RNA濃度的log值，再推算出RNA的濃度。
4. 對定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照FAM通道的Ct必須大于或等于40。陽性對照FAM通道的熒光信號必須有對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于35。對待測樣品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果其HEX通道的Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
自備試劑
樣品RNA
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
自備試劑
樣品RNA
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
