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釀酒酵母探針法qPCR試劑盒(含內(nèi)參)
產(chǎn)品及特點
釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）又稱面包酵母或出芽酵母，是一種與人類關(guān)系廣泛的酵母。其細胞為球形或卵形，直徑5-10 μm，繁殖方法為出芽生殖。釀酒酵母被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。因此，快速檢測釀酒酵母感染具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法qPCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測釀酒酵母感染的試劑盒，它具有下列特點：
產(chǎn)品及特點
釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae ）又稱面包酵母或出芽酵母，是一種與人類關(guān)系廣泛的酵母。其細胞為球形或卵形，直徑5-10 μm，繁殖方法為出芽生殖。釀酒酵母被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域。因此，快速檢測釀酒酵母感染具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法qPCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測釀酒酵母感染的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達到100拷貝/反應(yīng)。
3. 提供陽性對照，用于制備標準曲線和用作擴增對照，排除假陰性實驗。
4. 提供外源性內(nèi)參，便于排除PCR假陰性樣本。
5. 特異性高，靶分子的引物和探針是根據(jù)釀酒酵母DNA高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
6. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級。
7. 本產(chǎn)品足夠50次20 μL體系的探針法PCR反應(yīng)。
8. 本產(chǎn)品只能用于科研0 μL體系的探針法RT-PCR反應(yīng)。
9. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
500μL |
0.5mL本色管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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釀酒酵母PCR引物-探針干粉（含內(nèi)參引物探針） |
50次 |
0.5mL棕蓋管 |
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釀酒酵母PCR陽性對照(1E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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外源性內(nèi)參(1E4拷貝/μL) |
250μL |
0.5mL白蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入220 μL超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標準曲線樣品以陽性對照1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
稀釋標準曲線樣品以陽性對照1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1，0。
2. 在0號管中加入280 μL熒光PCR專用模板稀釋液，35 μL本試劑盒提供的外源性內(nèi)參，震蕩一分鐘混勻。
3. 用帶芯槍頭分別將上步得到的混合液按45 μL/管加入到標記的1-6號管中，用帶芯槍頭（下同）。
4. 在6號管中加入5 μL 1E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
7. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線陽性樣品，每個樣品中內(nèi)參的濃度固定為1E3拷貝/μL。放冰上待用。
樣品DNA的制備
8. 如果有N個樣品，設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10 μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。在所有待純化樣本、PC樣本和NC樣本中分別加入5 μL本試劑盒提供的外源性內(nèi)參（共5千拷貝）。
9. 用自選方法純化樣品的DNA（含內(nèi)參），本試劑盒跟市場上大多數(shù)DNA提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應(yīng)20 μL體系，在樣品制備室進行
10. 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 陰性陽性判斷：沒有Ct讀數(shù)，或Ct大于40判為陰性結(jié)果。有Ct讀數(shù)，Ct值小于40，熒光信號有對數(shù)增長，有典型擴增曲線判為陽性結(jié)果。每個樣本需要對FAM通道和Cy5通道的結(jié)果分別進行判定，得到兩個結(jié)果。
2. 實驗有效性判斷：如果擴增陽性對照或制備陽性對照FAM通道結(jié)果為陰性則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要分析原因，可能是操作、儀器和試劑三方面的原因，重做擴增或制備或跟儀器和試劑廠家聯(lián)系。如果擴增陰性對照或制備陰性對照FAM通道結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要分析失敗原因，直到污染消除。如果陽性對照和陰性對照正常，則進入下一步分析樣本的有效性。
3. 樣本有效性判斷：如果樣本FAM通道的結(jié)果為陽性，則無論內(nèi)參Cy5通道的結(jié)果是陰性還是陽性，樣本的結(jié)果均有效。如果樣本結(jié)果為陰性，內(nèi)參通道結(jié)果也為陰性，則此樣品的陰性結(jié)果無效。此樣品需要重新提取核酸和進行擴增。
4. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，分別以陽性對照FAM通道和內(nèi)參Cy5通道的Ct值為縱軸，繪制標準曲線，陽性對照FAM通道讀數(shù)的標準曲線為斜線，r2必須大于0.95，內(nèi)參Cy5通道讀數(shù)的標準曲線為一條跟X軸平行的橫線。再以待測樣品的Ct值從陽性對照FAM通道讀數(shù)的標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
5. 如果用于定性實驗，對待測樣品，如果其FAM通道的Ct沒有讀數(shù)、或Ct大于或等于40則均為陰性，如果小于40則為陽性。對任何FAM通道結(jié)果為陰性的待測樣本，如果其對應(yīng)的內(nèi)參Cy5通道也為陰性，則此樣品的陰性結(jié)果無效，此樣品需要重復實驗。樣本，如果其對應(yīng)的內(nèi)參Cy5通道也為陰性，則此樣品的陰性結(jié)果無效，此樣品需要重復實驗。
自備試劑
樣品DNA
樣品DNA
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
