產(chǎn)品及特點

蓋塔病毒(Getah virus，GETV)屬于RNA病毒披膜病毒科甲病毒屬成員，是一種經(jīng)蚊蟲在脊椎動物中傳播的蟲媒病毒，廣泛分布于東南亞和東亞地區(qū)。已證實GETV可引起家畜的疾病，如日本和印度曾多次發(fā)生該病毒感染馬或豬而導致的疾病流行，近期我國湖南省某地豬群中也發(fā)生蓋塔病毒病的流行。GETV血清學調(diào)查表明，人、多種家畜及某些野生動物中也存在該病毒感染，亞洲、歐洲、大洋洲一些國家的人、豬、馬、牛、山羊、犬、兔、袋鼠、雞和野鳥血清中均檢測到GETV病毒抗體，因此快速檢測蓋塔病毒具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量RT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測蓋塔病毒的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達到100拷貝/反應(yīng)。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)蓋塔病毒RNA高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 既用于定性檢測，又用于定量檢測。定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級。

6. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量qRT-PCR反應(yīng)。

7. 本產(chǎn)品只能用于科研。

規(guī)格及成分

成分	規(guī)格	包裝
探針法qRT-PCR緩沖液	500μL	0.5mL藍色蓋
探針法qRT-PCR酶混合液v2	50μL	0.5mL紅色蓋
熒光PCR專用模板稀釋液	1mL	1.5mL綠色蓋
蓋塔病毒qRT-PCR引物-探針混合液	50次	0.5mL棕色蓋
蓋塔病毒qRT-PCR陽性對照(1×10E7拷貝/μL)	50μL	0.5mL黃色蓋
使用手冊	1份	無
本產(chǎn)品采用五孔盒包裝

使用方法

稀釋標準曲線樣品以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。

1. 標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。

2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3. 在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

樣品DNA的制備

7. 如果有N個樣品，設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL上步所得4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。

8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)樣品RNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。

Probe qRT-PCR反應(yīng)20μL體系，在樣品制備室進行

9. 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復，則標記N+4個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），1個用于RT-PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

數(shù)據(jù)處理

1. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

2. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須沒有數(shù)值，等于或者大于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于40。對待測樣品，如果其Ct小于40則為陽性。如果沒有Ct值，或大于或等于40則為陰性。

自備試劑
樣品RNA

運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年

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