產(chǎn)品及特點

鴿副粘病毒(Pigeon Paramyxovirus，PPMV)是單分子單鏈RNA，基因組長度約為15200 nt，主要是負鏈，有時毒粒中也含有少量正鏈RNA，其病毒顆粒呈多形性，直徑150-250 nm，有一個比較堅硬的核衣殼。病毒通過受感染鴿子的糞便和鼻子、嘴巴和眼睛分泌物傳播，染病鴿子可能會表現(xiàn)出喘氣、咳嗽、抑郁、食欲不振、肌肉顫抖、翅膀下垂、頭頸部扭曲、盤旋、完全癱瘓、眼睛周圍組織腫脹和頸部、綠色、水樣腹瀉、畸形、粗糙或薄殼蛋以及產(chǎn)蛋量減少，嚴重時染病鴿子會出現(xiàn)突然死亡，造成養(yǎng)鴿人的經(jīng)濟損失。在人類中鴿副粘病毒可能引起輕度流感樣癥狀、結(jié)膜炎或喉炎，危害人類健康，因此快速檢測鴿副粘病毒具有重要的意義。為此，本公司以探針法qRT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)了鴿副粘病毒的檢測試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏度高，可以達到100拷貝/反應(yīng)。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)鴿副粘病毒RNA高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。定量檢測時線性范圍至少5個數(shù)量級。

6. 本產(chǎn)品足夠50次20 μL體系的探針法qRT-PCR反應(yīng)。

7. 本產(chǎn)品只能用于科研。

規(guī)格及成分

成分	規(guī)格	包裝
探針法qRT-PCR緩沖液	500μL	0.5mL藍蓋管
探針法qRT-PCR酶混合液v2	50μL	0.5mL紅蓋管
熒光PCR專用模板稀釋液	1mL	1.5mL綠蓋管
鴿副粘病毒qRT-PCR引物-探針干粉	50次	0.5mL棕色管
鴿副粘病毒qRT-PCR陽性對照(1E7拷貝/μL)	50μL	0.5mL黃蓋管
使用手冊	1份	無
本產(chǎn)品采用五孔盒包裝
注意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入165μL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。

使用方法

稀釋標準曲線樣品以1E1-1E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。如果需要RNA陽性樣品，需要另外訂購。

1. 標記6個離心管，分別為6、5、4、3、2、1。

2. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。

3. 在6號管中加入5 μL 1E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在5號管中加入5 μL 1E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在4號管中加入5 μL 1E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

6. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

樣品RNA的制備

7. 如果有N個樣品，設(shè)置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0 μL上步所得第4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次樣本制備所要求的起始樣本體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。

8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)RNA提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。

Probe qRT-PCR反應(yīng)20 μL體系，在樣品制備室進行

9. 如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復，則標記N+4個RT-PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），1個用于RT-PCR陽性對照（直接用第6步第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

數(shù)據(jù)處理

1. 如果樣本制備陽性對照或RT-PCR陽性對照(包括標曲樣本)結(jié)果為陰性，則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重新樣本制備，重新進行RT-PCR擴增或跟廠家聯(lián)系。如果樣本制備陰性對照或RT-PCR陰性對照結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系。

2. 如果陰性對照和陽性對照均正常，則實驗有效，可以進入后續(xù)分析。

3. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。

4. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須沒有讀數(shù)，或者大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于40。對待測樣品，如果其Ct沒有讀數(shù)、大于或等于40則均為陰性，如果小于40則為陽性。

自備試劑
樣品RNA，超純水，核酸純化試劑盒

運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年

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