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MS2病毒-MS3病毒雙重探針法qRT-PCR試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)
大腸桿菌MS2病毒是二十面體的單鏈正義RNA病毒，可感染大腸桿菌和腸桿菌科的其他成員。MS2病毒屬于輕巧病毒(Levivirus)家族的成員，其中包括病毒f2、病毒Qβ、病毒R17和病毒GA。其基因組含有3569個(gè)核苷酸，編碼成熟酶蛋白、衣殼蛋白、復(fù)制酶蛋白和裂解蛋白四種蛋白。與其組裝相關(guān)的蛋白為成熟酶蛋白和衣殼蛋白。今年，MS2病毒常用于構(gòu)建RNA診斷產(chǎn)品用的陽(yáng)性質(zhì)控品。
產(chǎn)品及特點(diǎn)
大腸桿菌MS2病毒是二十面體的單鏈正義RNA病毒，可感染大腸桿菌和腸桿菌科的其他成員。MS2病毒屬于輕巧病毒(Levivirus)家族的成員，其中包括病毒f2、病毒Qβ、病毒R17和病毒GA。其基因組含有3569個(gè)核苷酸，編碼成熟酶蛋白、衣殼蛋白、復(fù)制酶蛋白和裂解蛋白四種蛋白。與其組裝相關(guān)的蛋白為成熟酶蛋白和衣殼蛋白。今年，MS2病毒常用于構(gòu)建RNA診斷產(chǎn)品用的陽(yáng)性質(zhì)控品。
大腸桿菌MS3病毒是二十面體的單鏈正義RNA病毒，可感染大腸桿菌和腸桿菌科的其他成員。MS2病毒屬于輕巧病毒(Levivirus)家族的成員，其中包括病毒f2、病毒Qβ、病毒R17和病毒GA。其基因組含有3569個(gè)核苷酸，編碼成熟酶蛋白、衣殼蛋白、復(fù)制酶蛋白和裂解蛋白四種蛋白。與其組裝相關(guān)的蛋白為成熟酶蛋白和衣殼蛋白。今年，MS3病毒常用于構(gòu)建RNA診斷產(chǎn)品用的陽(yáng)性質(zhì)控品。
因此快速檢測(cè)MS2病毒具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法qRT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)MS2病毒和SM3病毒的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。
3. 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于排除假陰性結(jié)果。
4. 特異性高，引物和探針分別根據(jù)MS2病毒和MS3病毒RNA高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5各數(shù)量級(jí)。
6. 兩個(gè)探針分別用FAM和HEX標(biāo)記，檢測(cè)和分型同時(shí)完成。
7. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法RT-PCR反應(yīng)。
8. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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探針法qRT-PCR緩沖液 |
500μL |
0.5mL藍(lán)蓋管 |
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探針法qRT-PCR酶混合液 |
100μL |
0.5mL紅蓋管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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MS2病毒-SM3病毒RT-PCR引物-探針干粉（含內(nèi)參探針） |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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MS2病毒陽(yáng)性對(duì)照(1×10E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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MS3病毒陽(yáng)性對(duì)照(1×10E7拷貝/μL) |
250μL |
0.5mL白蓋管 |
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使用手冊(cè) |
1份 |
1份 |
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本產(chǎn)品采用十孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉(含內(nèi)參探針)在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入220uL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋含內(nèi)參的SM2病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以陽(yáng)性對(duì)照10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度和內(nèi)參固定在10E3拷貝/μL為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。
稀釋含內(nèi)參的SM2病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以陽(yáng)性對(duì)照10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度和內(nèi)參固定在10E3拷貝/μL為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2，1，0。
2. 在0號(hào)管中加入280μL熒光PCR專用模板稀釋液，35μL本試劑盒提供的內(nèi)參，震蕩一分鐘混勻。內(nèi)參的濃度為1111拷貝/μL。
3. 用帶芯槍頭分別將上步得到的混合液按45μL/管加入到標(biāo)記的1-6號(hào)管中，每管中含內(nèi)參50000拷貝。用帶芯槍頭（下同）。
4. 在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線PC樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 換槍頭，在4號(hào)管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線陽(yáng)性樣品，每個(gè)樣品中內(nèi)參的濃度固定為10E3拷貝/μL，總拷貝數(shù)為5×10E4。放冰上待用。
稀釋含內(nèi)參的SM3病毒檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品
8. 操作同上，只是使用SM3病毒的PC作為模板。得到6個(gè)濃度的樣本放冰上待用。
樣品RNA的制備
9. 如果有N個(gè)樣品，設(shè)置N+3個(gè)提取，多出的一個(gè)是SM2病毒的PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），多出的一個(gè)是SM3病毒的PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL第一步和第二步所得的兩個(gè)4號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟樣本制備試劑盒所要求的樣本體積一樣，以此分別作為兩個(gè)PC。另外用水作為NC，水和內(nèi)參的總體積需要跟樣本制備試劑盒所要求的樣本體積一樣。
10. 用自選方法純化樣品的RNA（含內(nèi)參），本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)RNA提取試劑盒兼容，也可以選購(gòu)本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qRT-PCR反應(yīng)20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行
11. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+3+1+6+6個(gè)RT-PCR管，其中N+3個(gè)用于上步得到的N+3個(gè)樣品，1個(gè)用于RT-PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于SM2病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，另外6個(gè)用于SM3病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+3+3個(gè)RT-PCR管，其中N+3個(gè)用于上步得到的N+3個(gè)樣品，1個(gè)用于RT-PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于SM2病毒RT-PCR陽(yáng)性對(duì)照，1個(gè)用于SM3病毒RT-PCR陽(yáng)性對(duì)照（直接用第一步和第二步所得的兩個(gè)4號(hào)稀釋液作為模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照或制備陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果為陰性，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴(kuò)增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴(kuò)增陰性對(duì)照或制備陰性對(duì)照結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明環(huán)境污染，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系，購(gòu)買新的引物和探針。
2. 如果陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照正常，則實(shí)驗(yàn)有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。
3. 對(duì)定量檢測(cè)，以標(biāo)曲樣本濃度的log值為橫軸，分別以SM2病毒陽(yáng)性對(duì)照（FAM通道）和SM3病毒陽(yáng)性對(duì)照（HEX通道）的Ct值為縱軸，繪制兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線，r2必須大于0.95。再以待測(cè)樣品的Ct值從分別從兩條標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出對(duì)應(yīng)樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 對(duì)定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照FAM通道的Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照FAM通道的熒光信號(hào)必須有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于35。對(duì)待測(cè)樣品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40則為SM2病毒陰性，如果小于或等于35則為SM2病毒陽(yáng)性。如果其HEX通道的Ct大于或等于40則為SM3病毒陰性，如果小于或等于35則為SM3病毒陽(yáng)性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性。
自備試劑
樣品RNA
樣品RNA
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
