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麻疹病毒和風(fēng)疹病毒雙重探針法qRT-PCR試劑盒
規(guī)格及成分
產(chǎn)品及特點
麻疹病毒（Measles Virus）是麻疹的病原體，分類上屬于副粘病毒科麻疹病毒屬，屬于單負(fù)鏈RNA病毒。麻疹是兒童常見的一種急性傳染病，其傳染性很強(qiáng)，以皮丘疹、發(fā)熱及呼吸道癥狀為特征；有研究發(fā)現(xiàn)亞急性硬化性全腦炎與麻疹病毒有關(guān)。風(fēng)疹病毒（Rubella Virus），屬節(jié)肢介體病毒中的披蓋病毒群，為風(fēng)疹的病原病毒，是單正鏈RNA病毒，屬于披膜病毒科是限于人類的病毒，兒童是主要易感者。癥狀為發(fā)熱、咽痛、咳嗽、耳后及枕部淋巴結(jié)腫痛。麻疹和風(fēng)疹病毒的易感人群均是兒童，且癥狀有一定的相似點；對麻疹病毒和風(fēng)疹病毒進(jìn)行快速檢測和區(qū)分兩種病毒具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針法qRT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門對麻疹病毒和風(fēng)疹病毒進(jìn)行檢測和區(qū)分的試劑盒，它具有下列特點：
麻疹病毒（Measles Virus）是麻疹的病原體，分類上屬于副粘病毒科麻疹病毒屬，屬于單負(fù)鏈RNA病毒。麻疹是兒童常見的一種急性傳染病，其傳染性很強(qiáng)，以皮丘疹、發(fā)熱及呼吸道癥狀為特征；有研究發(fā)現(xiàn)亞急性硬化性全腦炎與麻疹病毒有關(guān)。風(fēng)疹病毒（Rubella Virus），屬節(jié)肢介體病毒中的披蓋病毒群，為風(fēng)疹的病原病毒，是單正鏈RNA病毒，屬于披膜病毒科是限于人類的病毒，兒童是主要易感者。癥狀為發(fā)熱、咽痛、咳嗽、耳后及枕部淋巴結(jié)腫痛。麻疹和風(fēng)疹病毒的易感人群均是兒童，且癥狀有一定的相似點；對麻疹病毒和風(fēng)疹病毒進(jìn)行快速檢測和區(qū)分兩種病毒具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針法qRT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門對麻疹病毒和風(fēng)疹病毒進(jìn)行檢測和區(qū)分的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。
3. 提供陽性對照，便于排除假陰性結(jié)果。
4. 特異性高，引物是根據(jù)麻疹病毒和風(fēng)疹病毒RNA高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級。
6. 兩個探針分別用FAM和HEX標(biāo)記，檢測和分型同時完成。
7. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應(yīng)。
8. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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探針法qRT-PCR緩沖液 |
500μL |
0.5mL藍(lán)蓋管 |
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探針法qRT-PCR酶混合液v2 |
100μL |
0.5mL紅蓋管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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麻疹病毒和風(fēng)疹病毒雙重qRT-PCR引物-探針干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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麻疹病毒qRT-PCR陽性對照(1×10E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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風(fēng)疹病毒qRT-PCR陽性對照(1×10E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL白蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產(chǎn)品采用十孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入220uL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋麻疹病毒檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以陽性對照10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。
稀釋麻疹病毒檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以陽性對照10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。
1. 標(biāo)記6個離心管，分別為A6，A5，A4，A3，A2，A1。
2. 在A1-A6號管中各加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液。
3. 在A6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線PC樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在A5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在A4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作得到A1-A6共六個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線陽性樣品。放冰上待用。
稀釋風(fēng)疹病毒檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品
7. 操作同上，只是使用風(fēng)疹病毒的PC作為模板。得到6個濃度的樣本放冰上待用，分別是B1-B6。
樣品RNA的制備
8. 如果有N個樣品，設(shè)置N+3個提取，多出的一個是麻疹病毒的PC（樣品制備陽性對照），一個是風(fēng)疹病毒的PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0μL第一步和第二步所得的4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟樣本制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此分別作為兩個PC。另外用水作為NC，水的總體積需要跟樣本制備試劑盒所要求的樣本體積一樣。
9. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)樣品RNA提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qRT-PCR反應(yīng)20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行
10. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+3+1+6+6個PCR管，其中N+3個用于上步得到的N+3個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），6個用于麻疹病毒和風(fēng)疹病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，另外6個用于麻疹病毒和風(fēng)疹病毒的標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+3+3個RT-PCR管，其中N+3個用于上步得到的N+3個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），1個用于麻疹病毒和風(fēng)疹病毒RT-PCR陽性對照，1個用于麻疹病毒和風(fēng)疹病毒RT-PCR陽性對照（直接用第一步和第二步所得的兩個4號稀釋液作為模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果擴(kuò)增陽性對照或制備陽性對照結(jié)果為陰性，則整個擴(kuò)增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴(kuò)增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴(kuò)增陰性對照或制備陰性對照結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個擴(kuò)增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系，購買新的引物和探針。
2. 如果陰性對照和陽性對照正常，則實驗有效，可以進(jìn)入后續(xù)分析。
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，分別以陽性對照（FAM通道）和（HEX通道）的Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，陽性對照的標(biāo)準(zhǔn)曲線為斜線，r2必須大于0.95。再以待測樣品的Ct值從陽性對照的標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 對定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照FAM通道的Ct必須大于或等于40。陽性對照FAM通道的熒光信號必須有對數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于35。對待測樣品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40則為麻疹病毒和風(fēng)疹病毒陰性，如果小于或等于35則為麻疹病毒和風(fēng)疹病毒E型陽性。如果其HEX通道的Ct大于或等于40則為麻疹病毒和風(fēng)疹病毒陰性，如果小于或等于35則為麻疹病毒和風(fēng)疹病毒陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
自備試劑
超純水，樣品RNA
超純水，樣品RNA
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期2年
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期2年
