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草魚呼腸孤病毒2型探針法qRT-PCR試劑盒(含內(nèi)參)
產(chǎn)品及特點(diǎn)
草魚呼腸孤病毒2型（Grass Carp Reovirus 2,GCRV-2）是一種雙鏈RNA病毒，其對(duì)酸堿的耐受能力較強(qiáng)，可以通過水體或寄生蟲傳播給健康的草魚這些易感魚類。草魚呼腸孤病毒2型是目前已知的毒力強(qiáng)的呼腸孤病毒，主要引起1齡和2齡草魚出血病，死亡率一般為30~50%，甚至可以高達(dá)60~90%。草魚呼腸孤病毒2型不僅能感染草魚，還能感染青魚（Mylopharyngodon piceus）、麥穗魚（Pseudorasbora parva）、稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）、鰱（Hypophthalmichthys molitrix）等。該病毒流行廣、在中國、越南、緬甸等亞洲國家都有報(bào)道，同時(shí)其具有的危害大、死亡率高、發(fā)病季節(jié)長等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響了廣大養(yǎng)殖者的積極性和我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因此快速靈敏診斷草魚呼腸孤病毒2型具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量RT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)草魚呼腸孤病毒2型的含內(nèi)參試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
草魚呼腸孤病毒2型（Grass Carp Reovirus 2,GCRV-2）是一種雙鏈RNA病毒，其對(duì)酸堿的耐受能力較強(qiáng)，可以通過水體或寄生蟲傳播給健康的草魚這些易感魚類。草魚呼腸孤病毒2型是目前已知的毒力強(qiáng)的呼腸孤病毒，主要引起1齡和2齡草魚出血病，死亡率一般為30~50%，甚至可以高達(dá)60~90%。草魚呼腸孤病毒2型不僅能感染草魚，還能感染青魚（Mylopharyngodon piceus）、麥穗魚（Pseudorasbora parva）、稀有鮈鯽（Gobiocypris rarus）、鰱（Hypophthalmichthys molitrix）等。該病毒流行廣、在中國、越南、緬甸等亞洲國家都有報(bào)道，同時(shí)其具有的危害大、死亡率高、發(fā)病季節(jié)長等特點(diǎn)，嚴(yán)重影響了廣大養(yǎng)殖者的積極性和我國淡水養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。因此快速靈敏診斷草魚呼腸孤病毒2型具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量RT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)草魚呼腸孤病毒2型的含內(nèi)參試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。
3. 提供陽性對(duì)照，便于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線和用作擴(kuò)增對(duì)照，排除假陰性結(jié)果。
4. 含識(shí)別內(nèi)源性內(nèi)參的引物和探針，便于排除RT-PCR假陰性樣本。
5. 特異性高，靶分子的引物和探針是根據(jù)草魚呼腸孤病毒2型RNA高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。內(nèi)參的引物和探針根據(jù)草魚給gig2p基因設(shè)計(jì)。
6. 既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。
7. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針法RT-PCR反應(yīng)。
8. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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探針法 qRT-PCR 緩沖液 |
500μL |
0.5mL藍(lán)蓋管 |
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探針法qRT-PCR酶混合液v2 |
50μL |
0.5mL紅蓋管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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草魚呼腸孤病毒2型RT-PCR引物-探針干粉（含內(nèi)參引物探針） |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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草魚呼腸孤病毒2型RT-PCR陽性對(duì)照(1×10E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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使用手冊(cè) |
1份 |
無 |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入216uL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以陽性對(duì)照10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以陽性對(duì)照10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 在各管中加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液。
3. 在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號(hào)管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線陽性樣品。放冰上待用。
樣品RNA的制備
7. 如果有N個(gè)樣品，設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是制備PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是制備NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂么_認(rèn)是陽性的樣本作為陽性對(duì)照，用確認(rèn)是陰性的樣本作為陰性對(duì)照。
8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)RNA提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qRT-PCR反應(yīng)20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于RT-PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)RT-PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于RT-PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于RT-PCR陽性對(duì)照（直接用第6步第4號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 陰性陽性判斷：沒有Ct讀數(shù)，或Ct大于40判為陰性結(jié)果。有Ct讀數(shù)，Ct值小于40，熒光信號(hào)有對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線判為陽性結(jié)果。每個(gè)樣本需要對(duì)FAM通道和HEX通道的結(jié)果分別進(jìn)行判定，得到兩個(gè)結(jié)果。
2. 實(shí)驗(yàn)有效性判斷：如果擴(kuò)增陽性對(duì)照或制備陽性對(duì)照FAM通道結(jié)果為陰性則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要分析原因，可能是操作、儀器和試劑三方面的原因，重做擴(kuò)增或制備或跟儀器和試劑廠家聯(lián)系。如果擴(kuò)增陰性對(duì)照或制備陰性對(duì)照FAM通道結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要分析失敗原因，直到污染消除。如果陽性對(duì)照和陰性對(duì)照正常，則進(jìn)入下一步分析樣本的有效性。
3. 樣本有效性判斷：如果樣本FAM通道的結(jié)果為陽性，則無論內(nèi)參HEX通道的結(jié)果是陰性還是陽性，樣本的結(jié)果均有效。如果樣本結(jié)果為陰性，內(nèi)參通道結(jié)果也為陰性，則此樣品的陰性結(jié)果無效。此樣品需要重新提取核酸和進(jìn)行擴(kuò)增。
4. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的log值為橫軸，分別以陽性對(duì)照FAM通道和內(nèi)參HEX通道的Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，陽性對(duì)照FAM通道讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為斜線，r2必須大于0.95，內(nèi)參HEX通道讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為一條跟X軸平行的橫線。再以待測(cè)樣品的Ct值從陽性對(duì)照FAM通道讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
5. 如果用于定性實(shí)驗(yàn)，對(duì)待測(cè)樣品，如果其FAM通道的Ct沒有讀數(shù)、或Ct大于或等于40則均為陰性，如果小于40則為陽性。對(duì)任何FAM通道結(jié)果為陰性的待測(cè)樣本，如果其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參HEX通道也為陰性，則此樣品的陰性結(jié)果無效，此樣品需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
自備試劑
樣品RNA
樣品RNA
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期2年。
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期2年。
