隨機(jī)引物法DNA探針標(biāo)記試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)
本產(chǎn)品是基于Feinberg和Vogelstein發(fā)明的隨機(jī)引物標(biāo)記法而開(kāi)發(fā)出來(lái)的即用型DNA探針標(biāo)記試劑盒，標(biāo)記過(guò)程由雙鏈DNA熱變性、隨機(jī)引物與單鏈DNA結(jié)合、在Klenow DNA聚合酶催化下，引物的延伸合成DNA探針并摻入標(biāo)記的核苷酸三步組成，可用下面的示意圖表示：
本產(chǎn)品對(duì)Feinberg和Vogelstein經(jīng)典方法進(jìn)行了改良，它具有下列特點(diǎn)：
1. 提供的標(biāo)記反應(yīng)液整合了除酶和模板外的所有成分，簡(jiǎn)化了反應(yīng)加樣步驟，提高了標(biāo)記反應(yīng)的可重復(fù)性。
2. 使用無(wú)外切活性的Klenow exo- DNA聚合酶，已標(biāo)記DNA探針不會(huì)被酶降解，探針產(chǎn)量更高。
3. 快速，快1小時(shí)即可完成標(biāo)記反應(yīng)。
4. 得到的DNA探針比活性高（如果是同位素，可以達(dá)到10E9 cpm/ug DNA）。
5. 所需模版DNA量少，模板可以是線狀或環(huán)狀的、也可以是單鏈或雙鏈的，但長(zhǎng)度必須在100 bp以上。
6. 得到的探針長(zhǎng)度一般在200-400 nt之間（如果模板長(zhǎng)度在1kb以上），可以用于Southern雜交、Northern雜交、原位雜交、菌落和斑點(diǎn)印跡雜交等。
7. 本產(chǎn)品足夠5次標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。
8. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分
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規(guī)格
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包裝
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10×隨機(jī)引物標(biāo)記反應(yīng)液(自備標(biāo)記核苷酸型)
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10uL
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0.5mL綠蓋管
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Klenow exo-聚合酶
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5uL
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0.5mL紅蓋管
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dATP，2 mM
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10uL
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0.5mL白蓋管
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dTTP，2 mM
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10uL
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0.5mL紫蓋管
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dGTP，2 mM
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10uL
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0.5mL藍(lán)色管
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dCTP，2 mM
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10uL
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0.5mL黃蓋管
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標(biāo)記專用隨機(jī)引物溶液
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10uL
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0.5mL橙蓋管
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超純水
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1mL
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1.5mL本色管
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使用手冊(cè)
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1份
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無(wú)
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使用方法
注 意：隨機(jī)引物標(biāo)記效率跟起始模板量和保溫時(shí)間相關(guān)，雜交時(shí)需要探針DNA必須達(dá)到一定的濃度，其中探針/模板比越高，沒(méi)有標(biāo)記的模板DNA對(duì)雜交的競(jìng)爭(zhēng)性抑制越低。用戶在實(shí)驗(yàn)前可以根據(jù)下表選擇合適的起始模板量和保溫時(shí)間：
注 意：非同位素標(biāo)記基團(tuán)（如生物素和地高辛）疏水性強(qiáng)，易與塑料離心管表面非特異性結(jié)合，所以要硅化塑料離心管。模板DNA并非越多越好，否則沒(méi)有標(biāo)記的模板DNA在雜交時(shí)會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地抑制標(biāo)記DNA跟靶分子的雜交，反而降低雜交信號(hào)強(qiáng)度。
1. 沸水浴10分鐘，或在PCR儀上100℃加熱10分鐘徹底變性模板DNA，結(jié)束后需要立即放冰上待用。不能緩慢降溫，否則變性的模板DNA單鏈又會(huì)雜交形成雙鏈。
2. 離心數(shù)秒使所有液體集中在管底，如果標(biāo)記物為dTTP則加入除dTTP之外的三種核苷酸（dATP、dGTP、dCTP）各1 uL（共3uL，濃度均為2mM），自備的dTTP/標(biāo)記dUTP混合物1uL，加入1 uL Klenow exo聚合酶。如果標(biāo)記物為dCTP則加入除dCTP之外的三種核苷酸（dATP、dGTP、dTTP）各1 uL，以此類推。
注：dTTP/標(biāo)記dUTP混合物中dTTP和標(biāo)記dUTP的總濃度必須達(dá)到2mM，dTTP與生物素標(biāo)記dUTP或地高辛標(biāo)記的dUTP的比例在65：35為。但如果使用自備的其他標(biāo)記核苷酸，如fluorescein、hydroxycoumarin、resorufin和aminoallyl標(biāo)記的dUTP，則用戶需要自己摸索其與dTTP之間的比例，如果使用32P標(biāo)記的dUTP，則比活為3000Ci/mmol，濃度為好為10uCi/uL，并且不需要加入dTTP。
3. 輕柔吹打混勻。如有液滴沾在管壁上，離心數(shù)秒使所有液體集中在管底。
4. 37℃保溫1-20小時(shí)。反應(yīng)結(jié)束后加熱100℃ 5分鐘使DNA聚合酶變性，同時(shí)使DNA探針變性成單鏈，然后立即冰上冷凍。不能緩慢降溫，否則變性的模板DNA單鏈又會(huì)雜交形成雙鏈。
5. 變性后的標(biāo)記反應(yīng)液可以放-20℃長(zhǎng)期保存，也可以直接加入到雜交反應(yīng)液中進(jìn)行雜交。如果電泳檢測(cè)，標(biāo)記產(chǎn)物將是彌散狀態(tài)。
注 意：本方法標(biāo)記核苷酸摻入率極高，因此可以不經(jīng)純化直接使用。如果需要純化，不要用酚抽提法純化非同位素標(biāo)記的DNA探針，因?yàn)檫@些標(biāo)記分子（如生物素或地高辛等）疏水性強(qiáng)，能使標(biāo)記的DNA進(jìn)入疏水的有機(jī)相而丟失。只能選擇乙醇直接沉淀或Sephadex G50過(guò)柱回收（需另購(gòu)柱式探針純化試劑盒）。對(duì)比活高的同位素標(biāo)記探針，由于同位素其極其不穩(wěn)定，因此應(yīng)該立即使用，不要長(zhǎng)久放置。
自備試劑
0.5M EDTA（pH8.0），需要自備標(biāo)記的核苷酸
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
購(gòu)物車
幫助
021-54845833/15800441009
