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產(chǎn)品及特點
甲型流感病毒(Influenza Virus A)，也稱禽流感病毒，是一種常見負(fù)鏈RNA流感病毒，其病毒顆粒包含了8段不同的RNA基因。在病毒顆粒的表面，存在兩種為主要的蛋白質(zhì)，即血凝素(Hemagglutinin，H)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，N)，它們決定了病毒的亞型。其中，甲型流感病毒H3亞型主要在人群中廣泛傳播。甲型流感病毒H3亞型的H蛋白質(zhì)允許病毒侵入宿主細(xì)胞，而N蛋白質(zhì)則有助于病毒釋放出宿主細(xì)胞。這兩種蛋白質(zhì)也是流感病毒的主要抗原，它們決定了病毒的免疫原性和毒力。甲型流感病毒H3亞型感染人類會引發(fā)禽流感，該病癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數(shù)伴有嚴(yán)重的肺炎，嚴(yán)重者心、腎等多種臟器衰竭導(dǎo)致死亡，病死率很高。因此快速靈敏診斷甲型流感病毒H3亞型具有重要意義。本產(chǎn)品以探針法熒光定量RT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測甲型流感病毒H3亞型的試劑盒，它具有下列特點：
甲型流感病毒(Influenza Virus A)，也稱禽流感病毒，是一種常見負(fù)鏈RNA流感病毒，其病毒顆粒包含了8段不同的RNA基因。在病毒顆粒的表面，存在兩種為主要的蛋白質(zhì)，即血凝素(Hemagglutinin，H)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，N)，它們決定了病毒的亞型。其中，甲型流感病毒H3亞型主要在人群中廣泛傳播。甲型流感病毒H3亞型的H蛋白質(zhì)允許病毒侵入宿主細(xì)胞，而N蛋白質(zhì)則有助于病毒釋放出宿主細(xì)胞。這兩種蛋白質(zhì)也是流感病毒的主要抗原，它們決定了病毒的免疫原性和毒力。甲型流感病毒H3亞型感染人類會引發(fā)禽流感，該病癥狀主要表現(xiàn)為高熱、咳嗽、流涕、肌痛等，多數(shù)伴有嚴(yán)重的肺炎，嚴(yán)重者心、腎等多種臟器衰竭導(dǎo)致死亡，病死率很高。因此快速靈敏診斷甲型流感病毒H3亞型具有重要意義。本產(chǎn)品以探針法熒光定量RT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測甲型流感病毒H3亞型的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到100拷貝/μL。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)甲型流感病毒H3亞型RNA高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級。
6. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系
7. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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探針法qRT-PCR緩沖液 |
0.5mL |
0.5mL藍(lán)蓋管 |
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探針法qRT-PCR酶混合液v2 |
50μL |
0.5mL紅蓋管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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超純水 |
1mL |
1.5mL藍(lán)蓋管 |
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甲型流感病毒H3亞型qRT-PCR引物-探針干粉 |
50次 |
1.5mL棕色管 |
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甲型流感病毒H3亞型qRT-PCR陽性對照(1×10E7拷貝/μL) |
50μL |
1.5mL棕色管 |
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使用手冊 |
1份 |
無 |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入165uL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。
1. 標(biāo)記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同）。
3. 在6號管中加入5μL1×10E7拷貝/μL的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號管中加入5μL1×10E6拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號管中加入5μL1×10E5拷貝/μL的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
樣品RNA的制備
7. 如果有N個樣品，設(shè)置N+2個提取，多出的一個是樣品制備PC（樣品制備陽性對照），一個是樣品制備NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL陽性對照的10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為樣品制備PC。另外用水作為樣品制備NC。
8. 用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。
設(shè)置qRT-PCR反應(yīng)20μL體系，在樣品制備室進行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），5個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用試劑盒提供的陽性對照的10000倍稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果擴增陽性對照或制備陽性對照結(jié)果為陰性，則整個擴增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴增陰性對照或制備陰性對照結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個擴增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系，購買新的引物和探針。
2. 如果陰性對照和陽性對照正常，則實驗有效，可以進入后續(xù)分析。
3. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照必須無Ct或Ct大于或等于35。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于35，否則實驗無效。如果實驗有效，則分析待測樣品，如果無Ct或Ct大于或等于35，則為陰性。如果Ct小于35則為陽性。
自備試劑
樣品RNA，超純水
樣品RNA，超純水
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運輸，-20℃保存，有效期1年
