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產(chǎn)品及特點
流感病毒分為甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒最容易發(fā)生變異，流感大流行就是甲型流感病毒出現(xiàn)新亞型或舊亞型重現(xiàn)引起的。甲型流感病毒是A型流感病毒，根據(jù)H和N抗原不同，又分為許多亞型，H可分為18個亞型(H10~H108)，N可分為11個亞型(N7~N71)。甲型流感病毒 H3N2 亞型是甲型流感病毒的一種亞型。該病毒主要通過呼吸道飛沫傳播，也可通過接觸傳播。感染甲型流感病毒 H3N2 亞型后，癥狀與其他甲型流感病毒亞型相似，包括發(fā)熱、咳嗽、喉嚨疼痛、身體疼痛、頭痛、乏力等，嚴重時可能導(dǎo)致肺炎等并發(fā)癥，給人類的健康造成巨大危害。因此快速檢測甲型流感病毒H3N2亞型具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法qRT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的對甲型流感病毒H3N2亞型的分型檢測的試劑盒，它具有下列特點：
流感病毒分為甲、乙、丙三型，其中甲型流感病毒最容易發(fā)生變異，流感大流行就是甲型流感病毒出現(xiàn)新亞型或舊亞型重現(xiàn)引起的。甲型流感病毒是A型流感病毒，根據(jù)H和N抗原不同，又分為許多亞型，H可分為18個亞型(H10~H108)，N可分為11個亞型(N7~N71)。甲型流感病毒 H3N2 亞型是甲型流感病毒的一種亞型。該病毒主要通過呼吸道飛沫傳播，也可通過接觸傳播。感染甲型流感病毒 H3N2 亞型后，癥狀與其他甲型流感病毒亞型相似，包括發(fā)熱、咳嗽、喉嚨疼痛、身體疼痛、頭痛、乏力等，嚴重時可能導(dǎo)致肺炎等并發(fā)癥，給人類的健康造成巨大危害。因此快速檢測甲型流感病毒H3N2亞型具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法qRT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的對甲型流感病毒H3N2亞型的分型檢測的試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏度高，可以達到100拷貝/反應(yīng)。
3. 提供陽性對照，便于排除假陰性結(jié)果。
4. 特異性高，引物和探針分別根據(jù)甲型流感病毒H3N2亞型RNA高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。定量檢測時線性范圍至少為5個數(shù)量級。
6. 兩個探針分別用FAM和Cy5標記，檢測和分型同時完成。
7. 本產(chǎn)品足夠50次20 mL體系的探針法RT-PCR反應(yīng)。
8. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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探針法qRT-PCR緩沖液 |
500μL |
0.5mL本色管 |
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探針法qRT-PCR酶混合液v2 |
50μL |
0.5mL紅蓋管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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甲型流感病毒H3N2亞型RT-PCR引物-探針干粉 |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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甲型流感病毒H3亞型陽性對照(1E7拷貝/mL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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甲型流感病毒H3亞型陽性對照(1E7拷貝/mL) |
50μL |
0.5mL白蓋管 |
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使用手冊 |
1份 |
1份 |
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本產(chǎn)品使用十一孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入220 mL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。本試劑盒采用DNA作為陽性對照，不能有效監(jiān)控核酸純化和RT過程。如果需要RNA模板，需要另外定做。 |
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使用方法
稀釋甲型流感病毒H3亞型檢測標準曲線樣品以陽性對照1E1-1E6拷貝/mL這6個10倍稀釋度
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。
稀釋甲型流感病毒H3亞型檢測標準曲線樣品以陽性對照1E1-1E6拷貝/mL這6個10倍稀釋度
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。
1. 標記6個離心管，分別為A6、A5、A4、A3、A2、A1。
2. 在A1-A6號管中各加入45 mL熒光PCR專用模板稀釋液。
3. 在A6號管中加入5 mL 1E7拷貝/mL的陽性對照（試劑盒提供），充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/mL的標準曲線PC樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在A5號管中加入5 mL 1E6拷貝/mL的陽性對照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/mL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在A4號管中加入5 mL 1E5拷貝/mL的陽性對照（上步稀釋所得），充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/mL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作得到A1-A6共六個稀釋度的標準曲線陽性樣品。放冰上待用。
稀釋甲型流感病毒N2亞型檢測標準曲線樣品
7. 操作同上，只是使用甲型流感病毒N2亞型的PC作為模板。得到6個濃度的樣本放冰上待用，分別是B1-B6。
樣品RNA的制備
8. 如果有N個樣品，最好設(shè)置N+3個提取，多出的一個是甲型流感病毒H3亞型的PC（樣品制備陽性對照），一個是甲型流感病毒N2亞型的PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?0 mL第一步和第二步所得的4號稀釋液再加上一定量的水使總體積跟樣本制備試劑盒所要求的起始樣本體積一樣，以此分別作為兩個PC。另外用水作為NC，水的總體積需要跟樣本制備試劑盒所要求的樣本體積一樣。注意：本試劑盒采用DNA作為陽性對照，不能有效監(jiān)控核酸純化和RT過程。如果需要RNA模板，需要另外定做。
9. 用自選方法純化樣品的RNA。本試劑盒跟市場上大多數(shù)RNA提取試劑盒兼容，也可以選購本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qRT-PCR反應(yīng)20 mL體系，在樣品制備室進行
10. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標記N+3+1+6+6個RT-PCR管，其中N+3個用于上步得到的N+3個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），6個用于甲型流感病毒H3亞型的標準曲線，另外6個用于甲型流感病毒N2亞型的標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標記N+3+3個RT-PCR管，其中N+3個用于上步得到的N+3個樣品，1個用于RT-PCR陰性對照（用水做模板），1個用于甲型流感病毒H3亞型RT-PCR陽性對照，1個用于甲型流感病毒N2亞型RT-PCR陽性對照（直接用第一步和第二步所得的兩個4號稀釋液作為模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果擴增陽性對照或制備陽性對照結(jié)果為陰性，則整個擴增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴增陰性對照或制備陰性對照結(jié)果為陽性，說明環(huán)境污染，則整個擴增或制備實驗無效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系，購買新的引物和探針。
2. 如果陰性對照和陽性對照正常，則實驗有效，可以進入后續(xù)分析。
3. 對定量檢測，以標曲樣本濃度的log值為橫軸，分別以甲型流感病毒H3亞型陽性對照（FAM通道）和甲型流感病毒N2亞型陽性對照（Cy5通道）的Ct值為縱軸，繪制兩條標準曲線，r2必須大于0.95。再以待測樣品的Ct值從分別從兩條標準曲線上推算出對應(yīng)樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
4. 對定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照FAM通道的Ct必須大于或等于40。陽性對照FAM通道的熒光信號必須有對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于35。對待測樣品，如果其FAM通道的Ct大于或等于40則為甲型流感病毒H3亞型陰性，如果小于或等于35則為甲型流感病毒H3亞型陽性。如果其Cy5通道的Ct大于或等于40則為甲型流感病毒N2亞型陰性，如果小于或等于35則為甲型流感病毒N2亞型陽性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。
自備試劑
樣品RNA，超純水
樣品RNA，超純水
運輸及保存
低溫運輸，-20℃保存，有效期2年
低溫運輸，-20℃保存，有效期2年
