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多殺巴斯德菌探針?lè)╭PCR試劑盒(含內(nèi)參)
產(chǎn)品及特點(diǎn)
多殺巴斯德菌 (Pasteurella multocida)是重要的人獸共患條件性致病菌，它是革蘭氏陰性菌，屬巴氏桿菌科巴氏桿菌屬，可引起動(dòng)物急性、敗血性傳染病，如禽霍亂、牛和兔出血性敗血癥、豬肺炎和豬萎縮性鼻炎，人也可以經(jīng)過(guò)貓和狗咬傷后感染。因此快速檢測(cè)多殺巴斯德菌具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針?lè)╭PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專(zhuān)門(mén)檢測(cè)多殺巴斯德菌的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
多殺巴斯德菌 (Pasteurella multocida)是重要的人獸共患條件性致病菌，它是革蘭氏陰性菌，屬巴氏桿菌科巴氏桿菌屬，可引起動(dòng)物急性、敗血性傳染病，如禽霍亂、牛和兔出血性敗血癥、豬肺炎和豬萎縮性鼻炎，人也可以經(jīng)過(guò)貓和狗咬傷后感染。因此快速檢測(cè)多殺巴斯德菌具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針?lè)╭PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專(zhuān)門(mén)檢測(cè)多殺巴斯德菌的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開(kāi)即用，用戶(hù)只需要提供樣品DNA模板
2. 引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。
3. 提供陽(yáng)性對(duì)照，便于制備標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)和用作擴(kuò)增對(duì)照，排除假陰性結(jié)果。
4. 含識(shí)別內(nèi)源性?xún)?nèi)參的引物和探針，便于排除PCR假陰性樣本。
5. 特異性高，靶分子的引物和探針是根據(jù)多殺巴斯德菌DNA高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
6. 既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線(xiàn)性范圍至少為5各數(shù)量級(jí)。
7. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針?lè)≒CR反應(yīng)。
8. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
500μL |
0.5mL本色管 |
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熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL紅蓋管 |
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多殺巴斯德菌PCR引物-探針干粉（含內(nèi)參引物探針） |
50次 |
0.5mL白蓋管 |
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多殺巴斯德菌PCR陽(yáng)性對(duì)照(1E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃色管 |
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使用手冊(cè) |
1份 |
無(wú) |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入216 μL超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品以陽(yáng)性對(duì)照1E1-1E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例
稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品以陽(yáng)性對(duì)照1E1-1E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2，1。
2. 在各管中加入45 μL熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液。
3. 在6號(hào)管中加入5 μL 1E7拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在4號(hào)管中加入5 μL 1E5拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)樣品。放冰上待用。
6. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)陽(yáng)性樣品。放冰上待用。
樣品DNA的制備
7. 如果有N個(gè)樣品，設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是制備PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是制備N(xiāo)C（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂么_認(rèn)是陽(yáng)性的樣本作為陽(yáng)性對(duì)照，用確認(rèn)是陰性的樣本作為陰性對(duì)照。
8. 用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)DNA提取試劑盒兼容，也可以選購(gòu)本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應(yīng)20 μL體系，在樣品制備室進(jìn)行
9. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照（直接用第6步第4號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 陰性陽(yáng)性判斷：沒(méi)有Ct讀數(shù)，或Ct大于40判為陰性結(jié)果。有Ct讀數(shù)，Ct值小于40，熒光信號(hào)有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線(xiàn)判為陽(yáng)性結(jié)果。每個(gè)樣本需要對(duì)FAM通道和Cy5通道的結(jié)果分別進(jìn)行判定，得到兩個(gè)結(jié)果。
2. 實(shí)驗(yàn)有效性判斷：如果擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照或制備陽(yáng)性對(duì)照FAM通道結(jié)果為陰性則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要分析原因，可能是操作、儀器和試劑三方面的原因，重做擴(kuò)增或制備或跟儀器和試劑廠(chǎng)家聯(lián)系。如果擴(kuò)增陰性對(duì)照或制備陰性對(duì)照FAM通道結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明環(huán)境污染，則整個(gè)實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要分析失敗原因，直到污染消除。如果陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照正常，則進(jìn)入下一步分析樣本的有效性。
3. 樣本有效性判斷：如果樣本FAM通道的結(jié)果為陽(yáng)性，則無(wú)論內(nèi)參Cy5通道的結(jié)果是陰性還是陽(yáng)性，樣本的結(jié)果均有效。如果樣本結(jié)果為陰性，內(nèi)參通道結(jié)果也為陰性，則此樣品的陰性結(jié)果無(wú)效。此樣品需要重新提取核酸和進(jìn)行擴(kuò)增。
4. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，分別以陽(yáng)性對(duì)照FAM通道和內(nèi)參Cy5通道的Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，陽(yáng)性對(duì)照FAM通道讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為斜線(xiàn)，r2必須大于0.95，內(nèi)參Cy5通道讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為一條跟X軸平行的橫線(xiàn)。再以待測(cè)樣品的Ct值從陽(yáng)性對(duì)照FAM通道讀數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
5. 如果用于定性實(shí)驗(yàn)，對(duì)待測(cè)樣品，如果其FAM通道的Ct沒(méi)有讀數(shù)、或Ct大于或等于40則均為陰性，如果小于40則為陽(yáng)性。對(duì)任何FAM通道結(jié)果為陰性的待測(cè)樣本，如果其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參Cy5通道也為陰性，則此樣品的陰性結(jié)果無(wú)效，此樣品需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
自備試劑
樣品DNA
樣品DNA
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
