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隨機(jī)引物法DNA探針生物素標(biāo)記試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)
本產(chǎn)品是基于Feinberg和Vogelstein發(fā)明的隨機(jī)引物標(biāo)記法而開發(fā)出來的即用型DNA探針標(biāo)記試劑盒，標(biāo)記過程由雙鏈DNA熱變性、隨機(jī)引物與單鏈DNA結(jié)合、在Klenow DNA聚合酶催化下，引物的延伸合成DNA探針并摻入標(biāo)記的核苷酸三步組成，可用下面的示意圖表示：
產(chǎn)品及特點(diǎn)
本產(chǎn)品是基于Feinberg和Vogelstein發(fā)明的隨機(jī)引物標(biāo)記法而開發(fā)出來的即用型DNA探針標(biāo)記試劑盒，標(biāo)記過程由雙鏈DNA熱變性、隨機(jī)引物與單鏈DNA結(jié)合、在Klenow DNA聚合酶催化下，引物的延伸合成DNA探針并摻入標(biāo)記的核苷酸三步組成，可用下面的示意圖表示：
本產(chǎn)品對(duì)Feinberg和Vogelstein經(jīng)典方法進(jìn)行了改良，它具有下列特點(diǎn)：
1. 提供的標(biāo)記反應(yīng)液整合了除酶和模板外的所有成分，簡(jiǎn)化了反應(yīng)加樣步驟，提高了標(biāo)記反應(yīng)的可重復(fù)性。
2. 使用無外切活性的Klenow exo- DNA聚合酶，已標(biāo)記DNA探針不會(huì)被酶降解，探針產(chǎn)量更高。
3. 快速，1小時(shí)即可完成標(biāo)記反應(yīng)。
4. 所需模版DNA量少，模板可以是線狀或環(huán)狀的、也可以是單鏈或雙鏈的，但長(zhǎng)度必須在100 bp以上。
5. 得到的探針長(zhǎng)度一般在200-400 nt之間（如果模板長(zhǎng)度在1kb以上），可以用于Southern雜交、Northern雜交、原位雜交、菌落和斑點(diǎn)印跡雜交等。
6. 本產(chǎn)品足夠5次DNA探針地高辛標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。
7. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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5×隨機(jī)引物地高辛標(biāo)記反應(yīng)液 |
20uL |
0.5mL綠蓋管 |
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隨機(jī)引物(6堿基，無修飾)干粉 |
5次 |
0.5mL本色管 |
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Klenow exo-聚合酶，5U/uL |
5uL |
0.5mL紅蓋管 |
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超純水 |
1mL |
1.5mL藍(lán)蓋管 |
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使用手冊(cè) |
1份 |
無 |
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本產(chǎn)品使用五孔盒包裝 |
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使用方法
1. 首次使用本產(chǎn)品時(shí)，需要在隨機(jī)引物干粉管子中加入25uL超純水，渦旋震蕩30秒，短暫離心10秒。得隨機(jī)引物溶液，放冰上待用。
1. 首次使用本產(chǎn)品時(shí)，需要在隨機(jī)引物干粉管子中加入25uL超純水，渦旋震蕩30秒，短暫離心10秒。得隨機(jī)引物溶液，放冰上待用。
2. 在一干凈的塑料離心管中加入下列成分：
注 意：模板DNA并非越多越好，因?yàn)槟０錎NA沒有標(biāo)記，新合成的DNA才帶有標(biāo)記，因此模板DNA越多，在雜交反應(yīng)時(shí)這些沒有標(biāo)記的DNA對(duì)標(biāo)記DNA的競(jìng)爭(zhēng)性抑制就越強(qiáng)，降低雜交信號(hào)強(qiáng)度。
3. PCR儀上100℃加熱10分鐘使模板DNA徹底變性。
4. 立即放冰上待用。不能緩慢降溫，否則變性的模板DNA單鏈又會(huì)雜交形成雙鏈。
5. 離心數(shù)秒使所有液體集中在管底。
6. 加入1 uL Klenow exo DNA聚合酶，輕柔吹打混勻。此時(shí)反應(yīng)總體積為20uL。
7. 37℃保溫1-20小時(shí)。標(biāo)記效率跟模板DNA和保溫時(shí)間相關(guān)，模板越多，新合成探針多，但新合成探針/模板比例低，雜交信號(hào)低。模板越少，新合成探針少，但探針/模板比例高，雜交信號(hào)高。但探針少到一定程度，也不會(huì)有雜交反應(yīng)發(fā)生。因此用戶需要探針合成量和雜交信號(hào)強(qiáng)弱在這兩者之間進(jìn)行折衷選擇。
8. 反應(yīng)結(jié)束后加熱100℃ 5分鐘使DNA聚合酶變性，同時(shí)使DNA探針變性成單鏈。變性后的標(biāo)記反應(yīng)液可以放-20℃長(zhǎng)期保存，也可以直接將變性后的探針加入到雜交反應(yīng)液中進(jìn)行雜交。如果電泳檢測(cè)，標(biāo)記產(chǎn)物將是彌散狀態(tài)。
注 意：本方法標(biāo)記核苷酸摻入率極高，因此可以不經(jīng)純化直接使用。如果需要純化，不要用酚抽提法純化非同位素標(biāo)記的DNA探針，因?yàn)檫@些標(biāo)記分子（如生物素或地高辛等）疏水性強(qiáng)，能使標(biāo)記的DNA進(jìn)入疏水的有機(jī)相而丟失。只能選擇乙醇直接沉淀或Sephadex G50過柱回收（需另購(gòu)柱式探針純化試劑盒）。
自備試劑
模板DNA
模板DNA
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
