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杜氏假絲酵母探針?lè)╭PCR試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)
杜氏假絲酵母（Candida dubliniensis）是一種厚垣孢子和芽管陽(yáng)性酵母，主要存在于獲得性免疫缺陷綜合癥（AIDS）患者的口腔中。杜氏假絲酵母的衍生物對(duì)一些抗生素藥物具有抗藥性。杜氏假絲酵母的存在會(huì)影響抗生素的藥物作用，從而對(duì)治療造成不良影響，因此快速檢測(cè)杜氏假絲酵母具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針?lè)╭PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專門(mén)檢測(cè)杜氏假絲酵母的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
杜氏假絲酵母（Candida dubliniensis）是一種厚垣孢子和芽管陽(yáng)性酵母，主要存在于獲得性免疫缺陷綜合癥（AIDS）患者的口腔中。杜氏假絲酵母的衍生物對(duì)一些抗生素藥物具有抗藥性。杜氏假絲酵母的存在會(huì)影響抗生素的藥物作用，從而對(duì)治療造成不良影響，因此快速檢測(cè)杜氏假絲酵母具有重要的意義。本產(chǎn)品就是以探針?lè)╭PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專門(mén)檢測(cè)杜氏假絲酵母的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開(kāi)即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到100拷貝/μL。
3. 提供陽(yáng)性對(duì)照和內(nèi)參，便于排除假陰性結(jié)果。
4. 特異性高，引物是根據(jù)杜氏假絲酵母高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5各數(shù)量級(jí)。
6. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針?lè)≒CR反應(yīng)。
7. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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2×Probe qPCR MasterMix |
0.5mL |
0.5mL本色管 |
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熒光PCR專用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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杜氏假絲酵母PCR引物-探針干粉（含內(nèi)參探針） |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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杜氏假絲酵母PCR陽(yáng)性對(duì)照(1×10E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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杜氏假絲酵母PCR內(nèi)參(1×10E4拷貝/μL) |
250μL |
0.5mL白蓋管 |
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使用手冊(cè) |
1份 |
無(wú) |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入200μL超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋含內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以陽(yáng)性對(duì)照10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度和內(nèi)參固定在10E3拷貝/μL為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。
稀釋含內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以陽(yáng)性對(duì)照10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度和內(nèi)參固定在10E3拷貝/μL為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2，1，0。
2. 在0號(hào)管中加入280μL熒光PCR專用模板稀釋液，35μL本試劑盒提供的內(nèi)參，震蕩一分鐘混勻。
3. 用帶芯槍頭分別將上步得到的混合液按45μL/管加入到標(biāo)記的1-6號(hào)管中，用帶芯槍頭（下同）。
4. 在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 換槍頭，在4號(hào)管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線陽(yáng)性樣品，每個(gè)樣品中內(nèi)參的濃度固定為10E3拷貝/μL。放冰上待用。
樣品DNA的制備
8. 如果有N個(gè)樣品，設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL上步所得4號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。在所有樣本中加入5uL 本試劑盒提供的內(nèi)參（共50000拷貝）。
9. 用自選方法純化樣品的DNA（含內(nèi)參），本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)DNA提取試劑盒兼容，也可以選購(gòu)本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qPCR反應(yīng)20μL體系，在樣品制備室進(jìn)
10. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于PCR陽(yáng)性對(duì)照（直接用第6步第4號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照或制備陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果為陰性，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴(kuò)增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴(kuò)增陰性對(duì)照或制備陰性對(duì)照結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明環(huán)境污染，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系，購(gòu)買(mǎi)新的引物和探針。對(duì)任何陰性樣品，如果內(nèi)參無(wú)Ct，則此樣品的陰性結(jié)果無(wú)效，此樣品需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
2. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，分別以陽(yáng)性對(duì)照（FAM通道）和內(nèi)參（HEX通道）的Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，陽(yáng)性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)曲線為斜線，r2必須大于0.95，內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)曲線為一條跟X軸平行的橫線。再以待測(cè)樣品的Ct值從陽(yáng)性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。
3. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照FAM通道的Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照FAM通道的熒光信號(hào)必須有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于35。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽(yáng)性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性。對(duì)任何FAM通道結(jié)果為陰性的樣品，如果其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參HEX通道無(wú)Ct，則此樣品的陰性結(jié)果無(wú)效，此樣品需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
自備試劑
樣品DNA
樣品DNA
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
