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MS2噬菌體探針?lè)╭PCR試劑盒
產(chǎn)品及特點(diǎn)
大腸桿菌MS2噬菌體是二十面體的單鏈正義RNA病毒，可感染大腸桿菌和腸桿菌科的其他成員。MS2噬菌體屬于輕巧病毒(Levivirus)家族的成員，其中包括噬菌體f2、噬菌體Qβ、噬菌體R17和噬菌體GA。其基因組含有3569個(gè)核苷酸，編碼成熟酶蛋白、衣殼蛋白、復(fù)制酶蛋白和裂解蛋白四種蛋白。與其組裝相關(guān)的蛋白為成熟酶蛋白和衣殼蛋白。今年，MS2噬菌體常用于構(gòu)建RNA診斷產(chǎn)品用的陽(yáng)性質(zhì)控品。因此快速檢測(cè)MS2噬菌體具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針?lè)╭RT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專(zhuān)門(mén)檢測(cè)MS2噬菌體的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
大腸桿菌MS2噬菌體是二十面體的單鏈正義RNA病毒，可感染大腸桿菌和腸桿菌科的其他成員。MS2噬菌體屬于輕巧病毒(Levivirus)家族的成員，其中包括噬菌體f2、噬菌體Qβ、噬菌體R17和噬菌體GA。其基因組含有3569個(gè)核苷酸，編碼成熟酶蛋白、衣殼蛋白、復(fù)制酶蛋白和裂解蛋白四種蛋白。與其組裝相關(guān)的蛋白為成熟酶蛋白和衣殼蛋白。今年，MS2噬菌體常用于構(gòu)建RNA診斷產(chǎn)品用的陽(yáng)性質(zhì)控品。因此快速檢測(cè)MS2噬菌體具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針?lè)╭RT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的專(zhuān)門(mén)檢測(cè)MS2噬菌體的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1. 即開(kāi)即用，用戶(hù)只需要提供樣品RNA模板。
2. 引物和探針經(jīng)過(guò)優(yōu)化，分析靈敏性高，可以達(dá)到100拷貝/反應(yīng)。
3. 提供陽(yáng)性對(duì)照和內(nèi)參，便于排除假陰性結(jié)果。
4. 特異性高，引物是根據(jù)MS2噬菌體RNA高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他生物的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5各數(shù)量級(jí)。
6. 本產(chǎn)品足夠50次20μL體系的探針?lè)≧T-PCR反應(yīng)。
7. 本產(chǎn)品只能用于科研。
規(guī)格及成分
規(guī)格及成分
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成分 |
規(guī)格 |
包裝 |
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探針?lè)?/span>qRT-PCR緩沖液 |
500μL |
0.5mL藍(lán)蓋管 |
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探針?lè)?/span>qRT-PCR酶混合液v2 |
50μL |
0.5mL紅蓋管 |
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熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液 |
1mL |
1.5mL綠蓋管 |
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MS2噬菌體RT-PCR引物-探針干粉（含內(nèi)參探針） |
50次 |
0.5mL棕色管 |
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MS2噬菌體陽(yáng)性對(duì)照(1×10E7拷貝/μL) |
50μL |
0.5mL黃蓋管 |
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MS2噬菌體RT-PCR內(nèi)參(1×10E4拷貝/μL) |
250μL |
0.5mL白蓋管 |
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使用手冊(cè) |
1份 |
無(wú) |
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本產(chǎn)品采用五孔盒包裝 |
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注 意：引物-探針干粉(含內(nèi)參探針)在使用前需要短暫離心，然后在離心管中加入220uL的超純水充分混勻后再使用，未用完的需要-20℃保存。 |
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使用方法
稀釋含內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以陽(yáng)性對(duì)照10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度和內(nèi)參固定在10E3拷貝/μL為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
稀釋含內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品以陽(yáng)性對(duì)照10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度和內(nèi)參固定在10E3拷貝/μL為例
由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。
1. 標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為6，5，4，3，2，1，0。
2. 在0號(hào)管中加入280μL熒光PCR專(zhuān)用模板稀釋液，35μL本試劑盒提供的內(nèi)參，震蕩一分鐘混勻。內(nèi)參的濃度為1111拷貝/μL。
3. 用帶芯槍頭分別將上步得到的混合液按45μL/管加入到標(biāo)記的1-6號(hào)管中，每管中含內(nèi)參50000拷貝。用帶芯槍頭（下同）。
4. 在6號(hào)管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線PC樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在5號(hào)管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6. 換槍頭，在4號(hào)管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線陽(yáng)性樣品，每個(gè)樣品中內(nèi)參的濃度固定為10E3拷貝/μL，總拷貝數(shù)為5×10E4。放冰上待用。
樣品RNA的制備
8. 如果有N個(gè)樣品，設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的一個(gè)是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是NC（樣品制備陰性對(duì)照）?？梢杂?0μL第6步所得4號(hào)稀釋液再加上一定量的水使總體積跟樣本制備試劑盒所要求的樣本體積一樣，以此作為PC（共含5×10E5拷貝陽(yáng)性對(duì)照和5×10E4拷貝內(nèi)參）。另外用水作為NC，但需要加入5μL本試劑盒提供的內(nèi)參（共5×10E4拷貝），水和內(nèi)參的總體積需要跟樣本制備試劑盒所要求的樣本體積一樣。
9. 用自選方法純化樣品的RNA（含內(nèi)參），本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)RNA提取試劑盒兼容，也可以選購(gòu)本公司的免提取核酸釋放劑。
Probe qRT-PCR反應(yīng)20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行
10. 如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)RT-PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于RT-PCR陰性對(duì)照（用水做模板），6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè)RT-PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于RT-PCR陰性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于RT-PCR陽(yáng)性對(duì)照（直接用第6步第4號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
數(shù)據(jù)處理
1. 如果擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照或制備陽(yáng)性對(duì)照結(jié)果為陰性，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要重做擴(kuò)增或制備或跟廠家聯(lián)系。如果擴(kuò)增陰性對(duì)照或制備陰性對(duì)照結(jié)果為陽(yáng)性，說(shuō)明環(huán)境污染，則整個(gè)擴(kuò)增或制備實(shí)驗(yàn)無(wú)效，不需要分析數(shù)據(jù)，需要跟廠家聯(lián)系，購(gòu)買(mǎi)新的引物和探針。對(duì)任何陰性樣品，如果內(nèi)參無(wú)Ct，則此樣品的陰性結(jié)果無(wú)效，此樣品需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
2. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，分別以陽(yáng)性對(duì)照（FAM通道）和內(nèi)參（HEX通道）的Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，陽(yáng)性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)曲線為斜線，r2必須大于0.95，內(nèi)參的標(biāo)準(zhǔn)曲線為一條跟X軸平行的橫線。再以待測(cè)樣品的Ct值從陽(yáng)性對(duì)照的標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。
3. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照FAM通道的Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照FAM通道的熒光信號(hào)必須有對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于35。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽(yáng)性。如果在35-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性。對(duì)任何FAM通道結(jié)果為陰性的樣品，如果其對(duì)應(yīng)的內(nèi)參HEX通道無(wú)Ct，則此樣品的陰性結(jié)果無(wú)效，此樣品需要重復(fù)實(shí)驗(yàn)。
自備試劑
樣品RNA，超純水，核酸純化試劑盒
樣品RNA，超純水，核酸純化試劑盒
運(yùn)輸及保存
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，有效期1年
